05 实验五 转化及重组子的筛选.ppt

第1页：转化及重组子的筛选

实验名称

转化及重组子的筛选

所属课程

分子生物学实验

第2页：实验五内容目录

本实验内容

• 实验目的
• 实验原理
• 实验仪器、材料与试剂
• 实验步骤
• 实验结果及讨论

第3页：实验五 实验目的

• 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义；
• 学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。

第4页：转化的概念与原理

转化

将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。

原理

细菌处于 0℃、CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

第5页：羟基-钙磷酸复合物与热击

• 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，黏附于细胞表面；
• 经 42℃ 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物；
• 进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状；
• 将转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。

第6页：基因导入方法：电击法

基因导入方法　1）电击法（Gene transfer by electroporation）

本页图示利用瞬时高压电场使细胞膜形成可逆孔洞，使外源DNA分子进入受体细胞。

第7页：基因导入方法：基因枪法

基因导入方法　2）基因枪法（Biolistic bombardment）

本页图示以表面吸附DNA的高速金属微粒轰击受体细胞或组织，实现外源基因的导入。

第8页：农杆菌T-DNA转入植物细胞

本页图示 Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell，即农杆菌将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移并整合入植物细胞基因组的过程。

第9页：农杆菌感染叶片盘的再生

本页图示 Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium，即农杆菌感染后的叶片盘经选择培养再生成转基因植株的过程。

第10页：DNA重组示意

本页为DNA重组示意图，展示外源DNA片段与载体连接、形成重组DNA分子的过程。

第11页：Lac Z基因蓝白斑筛选

外源基因插入与否可通过载体上的 Lac Z 基因进行初步筛选：

• 有外源基因插入的细菌呈白斑；
• 无外源基因插入的细菌呈蓝斑。

第12页：α互补原理

本页图示 α互补（Alfa互补）原理：载体表达的 α 肽段与宿主 lacZ 缺陷产物互补，恢复 β-半乳糖苷酶活性，分解 X-Gal 使菌落呈蓝色；外源片段插入 Lac Z 基因后互补被破坏，菌落呈白色。

第13页：实验五 实验仪器

（一）仪器

• 恒温摇床
• 超净工作台
• 恒温水浴锅
• 恒温箱
• 微量取液器

第14页：实验五 实验材料

（二）材料

• 实验三所得连接产物；
• 实验四制备的大肠杆菌感受态细胞。

注：原文写作「实验四所得连接产物」与「实验五制备的大肠杆菌感受态细胞」，按实验顺序应为实验三的连接产物与实验四制备的感受态细胞。

第15页：实验五 试剂

（三）试剂

• LB固体培养基；
• 氨苄青霉素（Amp）100 mg/ml。

第16页：转化操作（一）

实验步骤：转化

1. 取适量连接产物加到分装的 200 μL 感受态细胞中，冰上混匀，冰浴 30 min（此过程中需倒含氨苄的LB平板）；
2. 42℃ 热激 90 s，迅速在冰浴中冷却 3～5 min；
3. 上述管中加入 600 μL LB 培养基，于 37℃ 振荡培养 45 min（此过程中在LB平板上涂布 X-Gal 40 μL 和 IPTG 20 μL）。

第17页：转化操作（二）

4. 取适量菌液涂布 LB 平板（含 Amp 50 μg/ml），室温涂布均匀（至菌液完全被吸干），于 37℃ 倒置，过夜培养；
5. 观察菌落，筛选阳性克隆。

第18页：实验五结果及讨论

实验结果及讨论

• 经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现象；
• 为确定外源基因已转化入细菌，需另外的酶切和 PCR 验证。

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