第1页：第五节细胞分子生物学研究方法
第五节 细胞分子生物学研究方法
本节介绍原位分子杂交、聚合酶链反应（PCR）、反义技术、基因转移与转染技术，以及基因敲除与敲进。
第2页：DNA变性、复性与杂交
- DNA 变性
- 当溶液中的 DNA 分子处于高温或高 pH 值（13）条件下，维持双螺旋的碱基互补对被破坏，DNA 双链解离成两条单链，这一过程叫 DNA 变性。
- DNA 复性
- 当温度降低至合适温度或恢复 pH 值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构，这一过程叫 DNA 复性，又叫 DNA 杂交。
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第5页：核酸分子杂交
核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的 DNA/DNA、RNA/RNA、RNA/DNA 互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。
第6页：原位杂交
原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交，叫原位杂交，可用于 DNA、RNA 定位研究。
第7页：荧光原位杂交
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）
本页介绍荧光原位杂交技术：用荧光标记的核酸探针与细胞或染色体上的互补序列杂交，在荧光显微镜下直接观察目标序列的位置。
第8页：聚合酶链反应技术
二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增 DNA 模板链的两端形成双链，由 DNA 聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。
第9页：PCR的三个反应步骤
PCR 具体过程：每个循环由变性、退火、延伸三步组成。
PCR 反应的三个步骤| 步骤 | 温度 | 变化 |
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| ①变性 | 95 ℃ | 双链 DNA 加热后解链，变成单链 |
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| ②退火 | 56 ℃ | 降低温度使引物与模板 DNA 单链结合 |
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| ③延伸 | 72 ℃ | 在 DNA 聚合酶作用下于引物 3′ 端延伸，一条链变成两条链 |
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第10页：反义技术
三、反义技术 反义核酸技术：主要是引入目的基因 mRNA 的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交而阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列互补配对后，用于表达目的基因的 mRNA 量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少。
第11页：反义技术的应用
反义技术的应用：
- ①基因功能的研究。
- ②病毒基因组功能的研究。
- ③作为药物。
- ④抗肿瘤作用。
第12页：基因转移技术
- 基因转移技术
- 将外源基因转移到受体菌或细胞内，使之在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术，它是重组 DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一。
- 方式
- 转化、转染。
第13页：转染技术
转染技术是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控、突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。
第14页：瞬时转染与稳定转染
- 瞬时转染
- 外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
- 稳定转染（永久转染）
- 外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在；整合概率很小，大约 1/10⁴ 转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记如来氨丙基转移酶（APH，新霉素抗性基因）、潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH）、胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
第15页：影响转染效率的细胞培养因素
影响转染效率的主要因素：1、细胞培养物。
- 健康的细胞培养物是成功转染的基础，不同细胞有不同的培养基、血清和添加物。
- 高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前 24 小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。
- 另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。
第16页：血清对转染效率的影响
2、血清。
- 大多数培养基在使用前需要加血清，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大差别，血清质量的变化直接影响转染效率。
- 转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源 DNA）以测试细胞生长是否正常。
- 有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此转染前要除血清；但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤甚至死亡，导致转染效率极低。
第17页：载体构建对转染的影响
3、载体构建。
- 转染载体（病毒载体、质粒 DNA、RNA、PCR 产物、寡核苷酸等）的构建也影响转染结果。
- 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑安全问题（如基因污染）。
- 载体的形态及大小对转染效率也有不同影响；如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择合适的启动子也很重要，同时做空载体正对照可排除毒性干扰。
第18页：DNA质量对转染的影响
4、DNA 质量。
- DNA 质量对转染效率影响非常大，一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理。
- 如果 DNA 不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
- 对原代细胞、悬浮细胞和造血细胞等内毒素敏感的细胞，可使用能去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。
第19页：转染技术的选择
5、转染技术：转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比例、细胞数量、培养及检测时间等。
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第21页：基因敲除与基因敲进
五、基因敲除与敲进。
- 基因敲除（knock out of gene）
- 利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。
- 基因敲进（knock in of gene）
- 利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达。
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第23页：基因敲除与敲进的意义
意义：
- ①研究基因功能。
- ②转基因动物的制备。
- ③用于药物筛选的动物模型。
- ④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物。
