05 2-4 细胞培养技术.ppt

第1页：第四节细胞培养技术

第四节 细胞培养技术

本节介绍体外细胞培养技术、细胞系与细胞融合技术（含单克隆抗体技术），随后进入第五节细胞分子生物学研究方法。

第2页：体外细胞培养技术

细胞培养（cell culture）

是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。

优点

在离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响；可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。

第3页：IN VITRO与IN VIVO

IN VITRO

离体的，即在玻璃容器中用培养细胞进行的实验；生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫 IN VITRO。

IN VIVO

在体内的，即在完整机体内进行的实验；在活细胞内发生的生化反应叫 IN VIVO。

第4页：原代培养与传代培养

原代培养（primary culture）

直接取材于有机体组织的细胞进行培养。

传代培养（secondary culture）

把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养。

细胞体外培养所需的一般条件：适宜的培养皿、血清成分、37 ℃、5% CO₂、95～100% 湿度、抗生素。

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第6页：细胞系

细胞系（cell line）

在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限地传代。

NIH3T3 细胞系

1963 年取自小鼠胚胎细胞建立。

Hela 细胞系

1952 年取自人宫颈癌细胞建立。

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第8页：细胞融合技术

二、细胞融合技术

本部分介绍细胞融合与异核体的概念、常用融合诱导剂，以及基于细胞融合的单克隆抗体技术。

第9页：细胞融合

（一）细胞融合（cell fusion）：是指将两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。

第10页：异核体

异核体：将两个不同类型的细胞融合，可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能，这种细胞叫异核体。常用灭活的仙台病毒或聚乙二醇（PEG）人工促使融合。异核体进行有丝分裂则可产生杂种细胞。

第11页：单克隆抗体技术

（二）单克隆抗体技术：B 淋巴细胞在抗原的刺激下增殖分化转变为浆细胞产生抗体。每一个 B 淋巴细胞只能接受单一的抗原刺激产生特异性抗体，从单个 B 淋巴细胞繁殖的细胞克隆可以得到均质的抗体，叫单克隆抗体（monoclonal antibody）。

第12页：杂交瘤技术的建立

B 淋巴细胞不能在体外无限增殖，故 1975 年 Köhler 和 Milstein 利用杂交瘤技术，使绵羊红细胞（SRBC）免疫后小鼠的 B 淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，建立产生抗 SRBC 单抗的杂交细胞株。它既具有 B 淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又具有肿瘤细胞在体外无限增殖的特点，可不断在细胞培养上清液中产生单抗。

第13页：杂交瘤细胞

B 淋巴细胞可产生抗体但在体外不易存活，小鼠骨髓瘤细胞可在体外培养生存并无限增殖。将小鼠骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的 B 淋巴细胞融合，这种融合细胞既具有肿瘤细胞无限增殖的特性，又具有 B 淋巴细胞分泌特异抗体的能力，称为杂交瘤细胞。

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第16页：单克隆抗体应用的局限

1. 1、完整 Ig 分子量大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效剂量。
2. 2、鼠源性抗体异质性。
3. 3、半衰期短，只有 5～6 小时。
4. 4、肿瘤细胞抗原性调变，抗体分子不能有效地与肿瘤抗原结合，使效价下降。

第17页：第五节细胞分子生物学研究方法

第五节 细胞分子生物学研究方法

本节介绍原位分子杂交、聚合酶链反应（PCR）、反义核酸技术、基因转移技术以及基因敲除与敲进。

第18页：DNA变性、复性与杂交

DNA 变性

当溶液中的 DNA 分子处于高温或高 pH 值（13）条件下，维持双螺旋的碱基互补对被破坏，DNA 双链解离成两条单链，这一过程叫 DNA 变性。

DNA 复性

当温度降低至合适温度或恢复 pH 值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构，这一过程叫 DNA 复性，又叫 DNA 杂交。

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第21页：核酸分子杂交

核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的 DNA/DNA、RNA/RNA、RNA/DNA 互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。

第22页：原位杂交

原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交，叫原位杂交，可用于 DNA、RNA 定位研究。

第23页：荧光原位杂交

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）

本页介绍荧光原位杂交技术：用荧光标记的核酸探针与细胞或染色体上的互补序列杂交，在荧光显微镜下直接观察目标序列的位置。

第24页：聚合酶链反应技术

二、聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）又叫体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增 DNA 模板链的两端形成双链，由 DNA 聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。

第25页：PCR的三个反应步骤

PCR 具体过程：每个循环由变性、退火、延伸三步组成。

第26页：反义核酸技术

三、反义核酸技术：主要是引入 mRNA 的反义序列或与目的基因互补配对的反义基因，通过它们的杂交阻遏或降低目的基因表达的一种方法。当引入的反义核酸与相应序列配对后，用于表达目的基因的 mRNA 量大大减少，使细胞中靶基因编码的蛋白合成量也大为减少。

第27页：反义技术的应用

反义技术的应用：

• ①基因功能的研究。
• ②病毒基因组功能的研究。
• ③作为药物。
• ④抗肿瘤作用。

第28页：基因转移技术

基因转移技术

将外源基因转移到受体菌或细胞内，使之在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术，它是重组 DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一。

方式

转化、转染。

第29页：转染技术

转染技术是指将外源分子如 DNA、RNA 等导入真核细胞的技术，它是研究基因表达调控、突变分析等的常规工具，随着功能研究的兴起，其应用越来越广泛。

第30页：瞬时转染与稳定转染

瞬时转染

外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

稳定转染（永久转染）

外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在；整合概率很小，大约 1/10⁴ 转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

第31页：影响转染效率的细胞培养因素

影响转染效率的主要因素：1、细胞培养物。

• 健康的细胞培养物是成功转染的基础，不同细胞有不同的培养基、血清和添加物。
• 高的转染效率需要一定的细胞密度，一般推荐在转染前 24 小时将细胞传代，这样可提供正常细胞代谢，增加对外源 DNA 摄入的可能。
• 另外一定要避免细菌、支原体或真菌的污染。

第32页：血清对转染效率的影响

2、血清。

• 大多数培养基在使用前需要加血清，血清质量的变化直接影响转染效率。
• 转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源 DNA）以测试细胞生长是否正常。
• 有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。

第33页：载体构建对转染的影响

3、载体构建。

• 转染载体（病毒载体、质粒 DNA、RNA、PCR 产物、寡核苷酸等）的构建也影响转染结果。
• 病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，此外还需考虑安全问题（如基因污染）。
• 载体的形态及大小对转染效率也有不同影响；如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择合适的启动子也很重要，同时做空载体正对照可排除毒性干扰。

第34页：DNA质量对转染的影响

4、DNA 质量：DNA 质量对转染效率影响非常大。如果 DNA 不纯，带少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

第35页：转染技术的选择

5、转染技术：转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂比例、细胞数量、培养及检测时间等。

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第37页：基因敲除

五、基因敲除与敲进　基因敲除（knock out of gene）：利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。

第38页：基因敲进

基因敲进（knock in of gene）：利用基因同源重组，将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。

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第40页：基因敲除与敲进的意义

意义：

1. ①研究基因功能。
2. ②转基因动物的制备。
3. ③用于药物筛选的动物模型。
4. ④转基因动物可作为“生物反应器”生产药物。