02 第二章 研究细胞的方法 2-1 显微镜技术.ppt

第1页：第一节显微镜技术

第二章 研究细胞的方法　第一节 显微镜技术

本节从显微镜与分辨率讲起，依次介绍光学显微镜技术（普通光镜、荧光显微镜、相差显微镜、共焦激光扫描显微镜）和电子显微镜技术（透射电镜、扫描电镜）。

第2页：明视距离

明视距离

物体在人眼视网膜上成像的大小和物体与眼睛的距离有关；物体离眼睛越近，视网膜上的物像越大，但眼睛曲光度随之增大，眼部肌肉越发疲劳。经测试在物体离人眼 25 cm 时看物体既清楚、眼肌也不疲劳，因此把人眼正常工作距离定为 25 cm，称之为明视距离。

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第4页：分辨力与分辨极限

分辨力（Resolution）

又叫分辨本领，是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。

分辨极限（Limit of resolution）

对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为 0.2 μm。

第5页：光镜分辨极限计算公式

光镜分辨极限由下式推算：R＝0.61λ /（n·sinθ）＝0.61×0.5 μm /（1.5×1）＝0.2 μm。式中 λ 为照明光波长，n·sinθ 即数值孔径。

第6页：数值孔径

数值孔径 N.A（n·sinθ）的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。

第7页：光学显微镜技术

二、光学显微镜技术

本部分介绍普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜和共焦激光扫描显微镜的原理、构造与样品制备。

第8页：普通光学显微镜的结构与放大倍数

显微镜结构（分三部分）：

• ①机械部分：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）。
• ②照明部分：反光镜、聚光镜。
• ③光学部分：目镜、物镜。

放大倍数＝目镜的放大倍数×物镜的放大倍数。

第9页：生物样品制备的固定与包埋

①固定：可使生物大分子交联、蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象；常用固定剂有甲醛、戊二醛、乙醇。

②包埋：为了便于切片、防止样品移位；常用包埋剂为石蜡。

第10页：生物样品的切片

③切片：由于生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成 1～10 μm 的薄片。

第11页：细胞成分的选择性染色

染色必要性

细胞总重量的 70% 是水，对可见光来说几乎是透明的，因此未经处理的细胞在普通光镜下几乎看不见，常用染色方法使其可见。

苏木精

对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布。

伊红

可使细胞质染色。

第12页：人皮肤组织切片照片

本页为人皮肤组织切片照片，经苏木素、伊红（HE）染色，可分辨细胞核与细胞质的着色差异及皮肤组织的层次结构。

第13页：荧光显微镜技术

荧光显微镜技术（fluorescence microscopy）是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜，利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布。

第14页：自发荧光与诱发荧光

荧光（Fluorescence）

细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线，称为荧光。

自发荧光

由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。

诱发荧光

一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光。

第15页：荧光显微镜的基本构造

荧光显微镜的基本构造

本页以示意图展示荧光显微镜的光路构成，包括紫外光源、激发滤光片、分色镜、阻断滤光片与物镜、目镜系统。

第16页：相差显微镜技术

相差显微镜技术：只有光线通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见；但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化。因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。

第17页：相差显微镜的两个特殊部件

• 相差显微镜比普通光镜多了 2 个部件：
• 1）在聚光器上增加一个环形光阑。
• 2）在物镜后焦面增加一个相板，相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其它区域透过的光超前或滞后 1/4 λ，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。

第18页：光波的干涉与衍射

光波的干涉　光波的衍射

本页以示意图展示光波的干涉与衍射现象，为理解相差显微镜把相位差转换为振幅差提供光学基础。

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第20页：相差显微镜的暗反差

光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了 1/4 λ。只有未发生偏折的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板环形区的光不同的 1/4 λ 的光程差。两组光在平面上成像：如相板的环形区使直射光超前 1/4 λ，加上开始直射光超前的 1/4 λ，直射光共超前 1/2 λ，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。

第21页：相差显微镜的明反差

如相板的环形区使直射光滞后 1/4 λ，加上开始直射光超前的 1/4 λ，两者相抵，直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比，相差显微镜可观察活细胞的各种活动，如细胞迁移、分裂、运动等。

第22页：共焦激光扫描显微镜

5、共焦激光扫描显微镜技术（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）

本页引出共焦激光扫描显微镜，后续两页说明其成像原理与三维重组方法。

第23页：共焦激光扫描显微镜的成像原理

共焦激光扫描显微镜技术是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。共焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。

第24页：共焦显微镜的三维重组

在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动，改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组，就能获得样品的立体结构图像。

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第27页：电子显微镜技术的由来

三、电子显微镜技术：光镜分辨极限为 0.2 μm，小于 0.2 μm 的微细结构可使光波产生衍射现象，这种光波经过物体时可绕过物体，就像无物体经过一样，因此无法用光镜观察，这就需要一种分辨力更大的仪器来观察比 0.2 μm 更小的物体的微细结构。

第28页：电子波长与电镜原理

电子波长比光波短得多，用电子波代替光波可提高显微镜的分辨力，电镜就是根据这样的原理产生的。

第29页：电子显微镜的分辨率单位

电子显微技术中的常用度量单位是埃（Å）：1 Å＝10⁻¹ nm＝10⁻⁴ μm＝10⁻⁷ mm＝10⁻¹⁰ m。图中所示相邻两个原子之间的距离是 2 Å。

第30页：第一台透射电镜的诞生

电镜的历史：1938 年 Ruska 生产出第一台透射电镜。

第31页：扫描电镜的设计与诞生

电镜的历史：1935 年法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思想和工作原理；1942 年剑桥大学的马伦首次制成世界第一台扫描电镜。

第32页：电镜的分类

电镜按成像方式分为两类：

• 透射电镜（Transmission electron Microscope，TEM）。
• 扫描电镜（Scanning electron Microscope，SEM）。

第33页：透射电镜

1、透射电镜

本部分介绍透射电镜的标本制备过程（取材、固定、脱水、包埋、切片、染色）以及负染法、真空镀膜法、整装细胞电镜技术、冷冻蚀刻复型技术等提高反差的方法。

第34页：

第35页：透射电镜标本的取材要求

• 取材要求：
• 尽可能保持生活状态，避免损伤。
• 标本必须耐真空。
• 由于电子穿透力弱，标本必须超薄。
• 标本反差应尽可能大（生物材料原子系数低，图像反差差，不易出现明暗差别）。

第36页：透射电镜标本的固定

固定：为防止生物样品在死亡后和脱水过程中产生结构改变，离体生物标本需迅速固定。常用戊二醛和四氧化锇固定：戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键，将它们交联在一起；四氧化锇除与蛋白共价结合外，还对脂类有良好的固定效果。

第37页：脱水、包埋、切片与染色

1. 脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察，而电镜不能观察含水的生物标本，因此需经脱水处理；又因包埋剂与水不溶，用脱水剂可将组织中游离水脱去，有利包埋。
2. 包埋：为使柔软生物组织制成超薄切片，并使切片耐受高真空、电子轰击，切片前将标本进行包埋，常用环氧树脂。
3. 切片：电子穿透力很弱，需将样品制成 50～100 nm 厚的薄片。
4. 染色：生物分子由原子序数低的轻元素组成，散射电子能力弱，在电镜下几乎不存在明暗反差，需进行染色，常用染色剂为醋酸铀、枸橼酸铅。

第38页：提高样品反差的方法

2）提高样品反差的方法

本部分介绍负染法、真空镀膜法、整装细胞电镜技术和冷冻蚀刻复型电镜技术四种提高样品反差的制样方法。

第39页：负染法

负染法（negative staining）：将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上，滴加磷钨酸，样品干燥后重金属盐沉积于样品周围，使样品和背景形成显著的明暗对比，这种染背景而不染样品的方法叫负染。

第40页：真空镀膜法

真空镀膜法（metal shadowing）：把铂或钯等重金属接受高温蒸发，金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜，膜的厚度反映了样品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。

第41页：整装细胞电镜技术

整装细胞电镜技术：应用高锰酸钾固定剂，将细胞中大部分蛋白质性结构破坏，而内质网等膜性细胞器保存下来。这样不需超薄切片，细胞中的内质网膜系统及高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性结构就能显现出来。

第42页：冷冻蚀刻复型电镜技术

冷冻蚀刻复型电镜技术（freeze etching replica electron microscopy）：将标本用液态超低温冷冻，真空中割断，升温使冰升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷，膜和其它一些结构显露出来，增强了断面的浮雕效果——蚀刻。标本蚀刻后以 45° 喷金、90° 喷碳后将组织溶解掉，剩下的碳-金属膜就是复型，将复型膜置于透射电镜下观察，可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。

第43页：冷冻与断裂

冷冻

用制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样品固定。

断裂

在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见各种细胞内结构。

第44页：蚀刻

蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的地方因失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增强了断面的浮雕效果。

第45页：复型与剥膜

复型

以 45° 喷铂金、90° 喷碳固定，显示立体结构。

剥膜

将样品取出，浸泡于腐蚀液中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂-碳复型膜，捞于载网上干燥后透射电镜观察。

第46页：扫描电子显微镜

二、扫描电子显微镜（scanning electron microscope）

本部分先展示若干扫描电镜照片实例，再介绍扫描电镜的成像原理、特点以及生物样品的制备与导电处理。

第47页：注射针头的扫描电镜照片

本页为注射针头的扫描电镜照片，展示针尖在高倍率下的表面形貌。

第48页：果蝇的扫描电镜照片

本页为不同倍率的果蝇扫描电镜照片，可对比低倍下的整体形态与高倍下的局部细微结构。

第49页：黑白照片的计算机彩色处理

本页说明扫描电镜照片可以用计算机将黑白照片处理成彩色，便于区分和显示不同结构。

第50页：肺细支气管粘膜的扫描电镜照片

本页为肺细支气管粘膜的扫描电镜照片，可分辨杯状细胞和纤毛细胞的表面形态与分布。

第51页：红血球的扫描电镜照片

本页为红血球的扫描电镜照片，显示红细胞的立体形态。

第52页：培养细胞的扫描电镜照片

本页为培养细胞的扫描电镜照片，显示体外培养细胞贴壁生长的表面形貌。

第53页：扫描电镜的成像原理

扫描电镜的成像原理

本页以示意图展示扫描电镜的成像过程：电子束在样品表面逐点扫描，激发出的二次电子等信号被探测器收集并转换为图像。

第54页：扫描电镜的高分辨率

扫描电镜的特点：高的分辨率。

第55页：扫描电镜的立体感

扫描电镜的特点：很强的立体感。

第56页：扫描电镜的放大倍率范围

扫描电镜的特点：放大倍率范围广。

第57页：扫描电镜的样品适应性

扫描电镜的特点：样品适应性大，应用范围广。

第58页：扫描电镜样品制备的重要性

SEM 所取得的迅速发展表明，仪器本身性能（如分辨力、多功能等）的不断提高固然重要，但样品制备技术的改良和日趋完善，则对 SEM 的应用与发展确实起到了积极促进作用。同时，样品制备的质量如何，也是能否发挥 SEM 仪器最佳性能、拍出理想图像照片的关键所在，因此 SEM 生物样品制备技术问题一直是电镜工作者不断创新的一个重要领域。

第59页：生物样品制备的基本要求

生物样品与金属、矿物等材料不同，具有以下特点：

• 质地柔软、容易变形。
• 导电性能差、二次电子发射率低。
• 含水量多，有的含水量达 80% 以上。

因此在处于高真空状态下的扫描电镜内观察生物样品时，必须严格遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的预处理。

第60页：扫描电镜样品制备的四条原则

1. （一）每一处理步骤及操作过程中，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有形貌及微细结构。
2. （二）去除样品内的水分，以利于维持 SEM 的真空度和防止对镜筒的污染；但在脱水和干燥处理时，要尽量避免和减少样品体积变小、表面收缩变形等人工损伤。
3. （三）降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。
4. （四）无论观察组织、细胞的表面或内部微细构造，都应注意辨认和保护观察面。

第61页：生物样品制备的基本操作程序

生物样品制备的基本操作程序

本页以流程图形式概括扫描电镜生物样品制备的基本操作程序，包括取材与清洗、固定、脱水、干燥、导电处理等环节。

第62页：临界点干燥法的工作原理

临界点干燥是根据物质存在着临界状态的物理特性而研制的。在温度和压力的变动之下，任何物质存在的固态、液态和气态三种形式都可以相互转化。实验证明，当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样，此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，物理学中将上述情况称为临界状态，将此时的温度和压力分别称为临界温度和临界压力。临界点干燥就是利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。

第63页：临界液的选择

一般将临界干燥中起临界干燥作用的液体称为媒介液（又称过渡液），其选择条件是临界温度及压力较低、价格便宜而且保存方便。液态 CO₂ 的临界温度为 31.4 ℃，临界压力为 72 kg/cm²，与其它媒介液相比更符合选择条件，因此在临界点干燥时液态 CO₂ 已被普遍使用。

第64页：临界点干燥的操作程序

1. 1）样品预处理。
2. 2）放置样品。
3. 3）注入液体 CO₂。
4. 4）CO₂ 置换。
5. 5）临界处理。
6. 6）放气取样。

第65页：生物样品的导电处理

生物样品尤其是经干燥处理的样品，其表面电阻率很高、导电性能很差，当接受电子束照射时易造成充电和放电效应，以致图像模糊不清。此外生物样品元素成分原子序数低、二次电子发射率低，也难得到反差适当的图像，为增加导电性能、提高二次电子发射率，必须对样品进行导电处理。