03 第三章 细胞生物学研究方法.ppt

第1页：第三章细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法

第2页：形成可验证的假说收集整理实验结

形成可验证的假说收集整理实验结果确定研究对象设计实验方案得出结论文献检索生物学研究模式生物不同物种享有共同分子机制对实验结果进行分析讨论

第3页：第一节、细胞形态结构的观察方法

• 第一节、细胞形态结构的观察方法
• 第二节、细胞组分的分析方法
• 第三节、细胞培养、细胞工程与显微操作技术

第4页：第一节细胞形态结构的观察方法

• 第一节细胞形态结构的观察方法
• 一、光学显微镜技术（light microscopy）
• 二、电子显微镜技术(Electro microscopy)
• 三、扫描遂道显微镜(scanning tunnelingmicroscope )

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第6页：第二节细胞组分的分析方法离心分

第二节细胞组分的分析方法离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术定量细胞化学分析技术

第7页：第三节细胞培养

• 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术
• 一、细胞的培养
• 二、细胞工程

第8页：一、光学显微镜技术

• 一、光学显微镜技术（light microscopy)
• 1、普通复式光学显微镜技术
• 2、荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
• 3、激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）
• 4、暗视野显微镜（Dark Field Microscope）
• 5、相差显微镜（phase-contrast microscope）
• 6、微分干涉显微镜（differential interference contrast microscope, DIC）
• 7、录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）

第9页：二、电子显微镜技术电子显微镜

• 二、电子显微镜技术电子显微镜的基本知识
• 电镜与光镜的比较
• 电镜与光镜光路图比较
• 电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术
• 超薄切片技术
• 负染色技术与金属投影
• 覆膜与冰冻蚀刻技术
• 电镜三维重构技术扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

第10页：三、扫描遂道显微镜ScanningPro

• 三、扫描遂道显微镜ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
• 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统
• 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高
• （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）
• （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息
• （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作
• 非破坏性测量
• （4）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构

第11页：利用扫描隧道电子显微镜观察到

利用扫描隧道电子显微镜观察到的DNA分子

第12页：普通复式光学显微镜技术光镜样本

普通复式光学显微镜技术光镜样本制作分辨率是指区分开两个质点间的最小距离

第13页：荧光显微镜技术

• 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）荧光显微镜的原理荧光显微镜的应用
• 直接荧光标记技术
• 间接免疫荧光标记技术
• 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：绿色荧光蛋白

第14页：Green Fluorescence p

Green Fluorescence protein，GFP

第15页：This photograph was

This photograph was made with white light with no exciter filter and no barrier filter.This photograph was made with the NightSea blue exciter filter in place, but no barrier filter, The fluore-scence of the border appears pink and the center blue-green, and blue light is reflected from all other surfaces.This photograph was made with both the blue exciter filter and yellow barrier filter in place.

第16页：利用GFP进行的蛋白质的基因工程

利用GFP进行的蛋白质的基因工程化改造

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第18页：直接荧光标记技术利用直接荧光标

• 直接荧光标记技术利用直接荧光标记技术进行样品的观察，需要对样品进行荧光染色
• 标记荧光素的样品在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发后会发生不同颜色的荧光
• 常用的荧光染料有以下几种：rhodamine，受到黄绿光激发后发红色荧光Fluorescein，受到蓝光激发后发绿色荧光Texas red，受到激发后发红色荧光Cy3，受到激发后发橙色荧光

第19页：间接免疫荧光标记技术由于直接荧

• 间接免疫荧光标记技术由于直接荧光标记后样品产生的荧光强度较弱，同时无法特异性地显示细胞内生物大分子，因此在此基础上发展起了间接免疫荧光标记技术
• 通过荧光标记的抗体与细胞内特异分子的结合来显示这些生物大分子在细胞中的分布

第20页：利用较短波长的光使样品受到激发

• 利用较短波长的光使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置，这种显微镜称为荧光显微镜
• 根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型

第21页：激光共焦扫描显微镜技术

激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。

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第24页：暗视野显微镜

• 暗视野显微镜(dark field microscope)相差显微镜（phase-contrast microscope）将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞
• 微分干涉显微镜（differential-interference microscope）偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感
• 适于研究活细胞中较大的细胞器
• 录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动

第25页：原理:暗视野显微镜是利用特殊的

• 原理:暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照射到标本的光线不能直接进入物镜，而由聚光镜周围斜射到标本上，使标本的表面产生散射光，通过目镜进入眼中，因此在黑暗的视野中呈现明亮的像
• 这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子

第26页：电镜与光镜的比较显微镜分辨本领

电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LM200nm100nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化TEM0.1nm电子束（0.01-0.9）电磁透镜要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

第27页：电镜与光镜光路图比较

电镜与光镜光路图比较

第28页：电子显微镜的基本构造

电子显微镜的基本构造

第29页：主要电镜制样技术超薄切片技术用

• 主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备过程超薄切片的要求电镜样品的染色负染色技术（Negativestaining）与金属投影复膜与冰冻蚀刻技术（Freezeetching）(技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构
• 三种常见电镜样品染色技术的比较电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术
• 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段

第30页：电镜样品的染色电镜图像的反差实

• 电镜样品的染色电镜图像的反差实质上电子密度的差异，它是由于样品不同部分之间电子散射能力的差异所产生的
• 由于生物样品主要由C、N、O等元素构成，这些元素原子序数低，散射电子的能力较弱，在电子散射能力上没有明显的差异，因此需要经过染色来增加样品的反差
• 利用重金属盐进行染色后，不同的结构成分上吸附不同数量的重金属原子，结合重金属较多的区域具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子密度的黑色，反之亦然

第31页：超薄切片的要求细胞的精细结构保存完好

• 超薄切片的要求细胞的精细结构保存完好
• 切片的厚度应在50nm左右，较薄的切片分辨率好，但反差较差，较厚的切片分辨率差，但反差较好
• 切片应耐受电子束的强烈轰击，包埋介质不发生变形或升华
• 切片应具有良好的反差
• 切片均匀

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第35页：扫描电子显微镜扫描电镜的原理电

• 扫描电子显微镜扫描电镜的原理电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象
• CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题

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第37页：离心分离技术用途

离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离

第38页：二、细胞内核酸

二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

第39页：DNA特异性的显示方法多糖的显示

DNA特异性的显示方法多糖的显示方法脂类物质的显示细胞中各种酶的显示

第40页：DNA特异性的显示方法Feulgen反应

DNA特异性的显示方法Feulgen反应：利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。

第41页：多糖的显示方法PAS

多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C—C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。

第42页：脂类物质的显示方法对脂类物质

• 脂类物质的显示方法对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理
• 苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色

第43页：细胞中各种酶的显示方法由于酶易

• 细胞中各种酶的显示方法由于酶易受外界条件影响而变性失活
• 因此对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的
• 因此在实验的过程中需在尽量保持酶的活性

第44页：三、特异蛋白抗原的定位与定性利

• 三、特异蛋白抗原的定位与定性利用免疫学方法进行胞内蛋白质定位的原理
• 免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限（图）
• 免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术细胞外蛋白质的分析
• 蛋白电泳(SDS-PAGE)
• 免疫印迹反应(Western-Blot)

第45页：细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧

• 细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的
• 将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位
• 抗原抗原抗体特异性结合免疫荧光标记免疫酶标记

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第48页：四、细胞内特异核酸的定位与定性

• 四、细胞内特异核酸的定位与定性用核酸探针确立特殊核苷酸序列在染色体上或在特殊类型细胞中的位置的方法称为原位杂交技术(insituhybridization)
• 把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹
• 将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列
• 利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southernblot，检测特定RNA序列的方法称为Northernblot
• PCR技术和DNA测序方法

第49页：

第50页：五、放射自显影技术

• 五、放射自显影技术
• 原理及应用：
• 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；
• 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
• 步骤：
• 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）———放射自显影

第51页：

第52页：六．定量细胞化学分析技术细胞显

• 六．定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）
• 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量
• 包括：紫外光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法流式细胞仪（FlowCytometry）
• 主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量
• 测定细胞群体中不同时相细胞的数量
• 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞
• 分离DNA含量不同的中期染色体

第53页：一、细胞的培养动物细胞培养

• 一、细胞的培养动物细胞培养
• 原代培养细胞（primaryculturecell）传代培养细胞（sub-culturecell）
• 细胞株（cellstrain）正常二倍体，接触抑制
• 细胞系（cellline）亚二倍体，接触抑制丧失
• 组织培养的意义植物细胞
• 类型：原生质体培养（体细胞培养）单倍体细胞培养（花药培养）

第54页：细胞培养的意义可以在离体条件下

• 细胞培养的意义可以在离体条件下观察研究细胞生命活动的规律
• 观察细胞对于各种生物活性物质的反应
• 通过细胞培养可以获得大量性状相同的细胞，是一种良好的实验材料

第55页：细胞培养：将动、植物细胞或组织

• 细胞培养：将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程
• 动物细胞培养的基本过程：取材分离细胞选择相同类型的细胞贴壁培养传代

第56页：

第57页：原代培养：从机体取出后立即进行

• 原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养
• 传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长

第58页：细胞株：原代培养的细胞一般传至

• 细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为
• 这种传代细胞称为细胞株
• 细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去
• 这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系
• 细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性
• 实验室中常用的细胞系

第59页：常用细胞系一览表

说明：源文件该表为扁平文本，按「名称 / 类型 / 来源」三列顺序对应还原。

第60页：二、细胞工程细胞工程是一种在细

• 二、细胞工程细胞工程是一种在细胞水平上运用细胞生物学和分子生物学的方法改变生物遗传性状的生物工程
• 细胞融合(fusion)与细胞杂交(hybridization)技术单克隆抗体（monocloneantibody）技术细胞拆合与显微操作技术其它技术遗传分析（mutant,knockout,knockin）

第61页：

第62页：石蜡切片的制作过程取材固定冲洗

石蜡切片的制作过程取材固定冲洗脱水透明包埋切片老化脱蜡复水染色透明镜检

第63页：为什么要对生物样品进行染色由于

• 为什么要对生物样品进行染色由于生物组织是无色透明的，因此样品在进行观察前一般要经过染色
• 不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，使样品产生足够的反差或产生不同波长的光谱以区分该种细胞组分

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第66页：右图所示为荧光显微镜下观察到

• 右图所示为荧光显微镜下观察到的小肠微绒毛的图像
• 荧光显微镜技术包括荧光直接标记技术和免疫荧光技术
• 利用Evans蓝进行染色，这种染料在荧光的激发下可发出红色荧光
• 黄绿色的荧光是GLT2（一种葡萄糖转移蛋白）荧光标记抗体的染色

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第69页：利用不同的显微镜所观察到的神经细胞

利用不同的显微镜所观察到的神经细胞：1）暗视野显微镜;2）相差显微镜;c)DIC

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第71页：电镜负染技术是20世纪60年代开始

• 电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，当时人们发现一些重金属离子能在核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，利用深色背景衬托出样品的精细结构，其图像如同一张照相的底片，因此称为负染色
• 是观察病毒等颗粒性样品的常用技术
• 上图为利用磷钨酸钾进行的烟草病毒的负染色
• 下图为铬金属投影

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第82页：酵母的基因组于1996年测序完成

酵母的基因组于1996年测序完成，其基因组含1.2×108个碱基对，约有6200个基因。

第83页：拟南芥的基因组于2000年测序完成

拟南芥的基因组于2000年测序完成，

是人类搞清的第一个植物物种的基因组，共有1.25×109个碱基对，约有25000个基因。

第84页：线虫的基因组于1998年测序完成

线虫的基因组于1998年测序完成，

是人类得到的第一个动物物种的基因组,共有109个碱基对，约含18400个基因。

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第86页：果蝇的基因组于2000年测序完成

果蝇的基因组于2000年测序完成，共有1.4×109个碱基对，约含13600个基因。

第87页：小鼠的基因组测序工作预计到2007年完成

小鼠的基因组测序工作预计到2007年完成，推测其基因组共有3.3×1010个碱基对，约含40000个基因。

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第90页：Hela细胞（左

Hela细胞（左）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞右）的培养

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