08 第八章 微生物的遗传育种.pptx

第1页：第八章微生物的遗传育种

第八章微生物的遗传育种

第2页：遗传变异的基本概念

遗传变异的基本概念

• 一、几个基本概念
• 遗传(heredity)：生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定（保守）的特性。
• 遗传型（或基因型）(genotype)：某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。

第3页：表型(phenotype

表型(phenotype

• 表型(phenotype)：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。遗传型（可能性）+环境条件→表型（现实性）
• 变异(variation)：生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。

第4页：饰变(modification

•饰变(modification)：外表的修饰性改变，不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。

饰变是不遗传的。

第5页：核酸是遗传物质的证明

核酸是遗传物质的证明

• 二、遗传变异的物质基础•三个经典实验
• 肺炎链球菌的转化实验
• 噬菌体的感染实验
• 植物病毒的重建实验

第6页：细菌转化现象的发现

细菌转化现象的发现

• 1、Discovery of bacterialtransformation（转化）
• 1928，Fred Griffithdiscovered thephenomenon of transformation inStreptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）
• He proposed the concept of transformingprinciple.

第7页：格里菲斯转化实验

Live SDead SLive RDead SLive RNon-pathogenicR strainPathogenic S strain?

第8页：

第9页：DNA是遗传物质的证明（一）

Discovery of DNA as genetic material（一）细菌培养试验热死S菌培养皿培养不生长活R菌培养皿培养长出R菌热死S菌+活R菌培养皿培养长出大量R菌及10-6S菌S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液培养皿培养长出大量R菌和少量S菌

第10页：DNA是遗传物质的证明（二）

Discovery of DNA as genetic material（二）+S–DNA+S–DNA及DNA酶以外的酶+S–DNA和DNA酶Live R + S–RNA+ S–protein+ S–capsule polysaccharideLive SLive R1944,O.T.Avery, C.M.Macleod and M.McCartydiscovered the genetic material-DNA

第11页：噬菌体感染实验

噬菌体感染实验

• 2、Phage infection
• 1952,Hershey and Chase, demonstratedconclusively that DNA is the genetic materialby using radioactively labeled phage virus T2as experimental model
• Phage infectionAttachment to cell surfaceInjection of genetic materials into host cellDirect the host cell to make new virusparticles

第12页：重建实验

3、TMV重建实验•1956，H. Fraenkel-ConratTMV:烟草花叶病毒; HRV:霍氏车前花叶病毒

第13页：核酸在胞内存在的七个水平

• 核酸在胞内存在的七个水平
• 细胞水平：单细胞与多细胞、性细胞与体细胞、单核与多核细胞；
• 细胞核水平：真核与原核、核内与核外、单核与多核等；
• 染色体水平：一套染色体、多套染色体、染色体基因组的大小等；

第14页：核酸水平

核酸水平

• 核酸水平：是DNA还是RNA、是复合还是裸露、是长还是短等；
• 基因水平：依基因功能可分为结构基因及调控基因等；
• 密码子水平：结构密码子、起始与终止密码子等；
• 碱基水平：突变的最低交换单位有A、T、G、C等。

第15页：

第16页：基因突变的特点与类型

基因突变的特点与类型

• 三、基因突变（Gene mutation）
• 基因突变（突变）：细胞内（或病毒体内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，突变概率一般为10-6~10-9。
• 突变率：某一细胞（或病毒体）在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变一般是独立发生的，双重突变的几率是各个突变几率的乘积。

第17页：基因突变的特点

基因突变的特点

• 1、基因突变的特点
• 自发性：突变可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。
• 稀有性：突变率极低。
• 诱变性：通过诱变剂的作用提高自发突变几率。
• 独立性：突变的发生一般是独立的。

第18页：稳定性

稳定性

• 稳定性：新的诱变性状是稳定的、可遗传的。
• 可逆性：野生型基因突变型基因
• 不对称性：突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。正向突变回复突变

第19页：基因突变的自发性与不对称性的证明

基因突变的自发性与不对称性的证明

• 2、基因突变的自发性与不对称性的证明
• 变量试验（fluctuation test）1943年，S. E. Luria和M. Delbrück
• 涂布试验（newcombe experiment）1949年，Newcombe
• 平板影印培养试验（replica plating）1952年，J. Lederberg

第20页：突变类型

突变类型

• 3、突变类型
• 非选择性突变株形态突变型(morphological mutant)抗原突变型(antigenic mutant)产量突变型(producing mutant)
• 选择性突变株条件致死突变型(conditional lethal mutant)抗性突变型(resistant mutant)营养缺陷型(auxotroph)

第21页：营养缺陷型

营养缺陷型•营养缺陷型：野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。

野生型(wild type)：从自然界分离到的在发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。

原养型(prototroph)：营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。

第22页：对DNA的损伤及其修复

4、UV对DNA的损伤及其修复•UV的作用机制：使同链DNA的相邻嘧啶形成共价结合的嘧啶二聚体，减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。

第23页：光复活作用

•光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。

所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和后续操作，并在黑暗条件下培养。

光解酶。

第24页：暗修复作用（切除修复）内切核酸酶外切核酸

•暗修复作用（切除修复）内切核酸酶外切核酸酶DNA聚合酶DNA连接酶

第25页：诱变育种与定向培育

四、菌种选育•选种从自然界中选种样品采集增殖培养（富集培养）分离纯化：平板划线分离法、平板表面涂布法、琼脂培养基浇注法。

从生产中选种。

第26页：定向培育优良菌株一种利用微生物的自发突变

•定向培育优良菌株一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。

卡介苗。

第27页：诱变育种

诱变育种•利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株。

包括诱变和筛选两个环节，其中筛选更重要。

第28页：诱变育种的基本环节

诱变育种的基本环节

第29页：诱变育种步骤1.选择简便有效的诱变剂

• 诱变育种步骤1.选择简便有效的诱变剂
• 物理诱变剂：UV、激光；X射线、γ射线和快中子
• 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物2.挑选优良的出发菌株

第30页：处理单孢子（或单细胞）悬液4.选用最适的

处理单孢子（或单细胞）悬液4.选用最适的

• 3.处理单孢子（或单细胞）悬液4.选用最适的诱变剂量
• UV剂量指强度与作用时间的乘积；
• 常以杀菌率作为诱变剂的相对剂量；
• 多采用杀菌率为70~75%甚至更低（30~70%）的相对剂量。

第31页：充分利用复合处理的协同效应6.设计或采用

5.充分利用复合处理的协同效应6.设计或采用高效筛选方案或方法1)初筛：以量为主，利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，可在培养皿或摇瓶中进行。

2)复筛：以质为主，一般采用摇瓶培养或台式发酵罐进行发酵，然后对培养液进行分析测定，选出较理想的菌种。

第32页：诱变因子的复合处理及其协同效应菌种单独处

诱变因子的复合处理及其协同效应菌种单独处理复合处理诱变剂突变率%诱变剂突变率%土曲霉紫外线21.3X射线+紫外线42.8X射线19.7土曲霉氮芥0.1%不明显氮芥+紫外线11.0紫外线4.7链霉菌紫外线31.0紫外线+γ射线43.6γ射线35.0金色链霉菌二乙烯三胺6.06二乙烯三胺+紫外线26.6（2U-84）硫酸二乙酯1.78硫酸二乙酯+紫外线35.86紫外线12.5灰色链霉菌紫外线9.8紫外线+可见光照射1次9.7（JIC-1)紫外线+可见光照射6次16.6

第33页：几个基本概念

• 几个基本概念
• 基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基。
• 完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
• 补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合或半组合培养基。

第34页：营养缺陷型的检出方法

营养缺陷型的检出方法

• 五、营养缺陷型（Auxotroph）的筛选
• 诱变剂处理
• 淘汰野生型，“浓缩”营养缺陷型细菌：青霉素法真菌：制霉菌素法丝状菌（真菌或放线菌）：菌丝过滤法

第35页：检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法影印平

检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法影印平

• 检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法影印平板法逐个检出法
• 鉴定缺陷型：生长谱法

第36页：转化、转导与接合

转化、转导与接合

• 六、基因重组（Gene recombination）
• 基因重组（或遗传重组）：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。
• 原核微生物的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。
• 真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。

第37页：转化

转化

• 1、Transformation（转化）
• 转化：受体菌（recipient cell）直接吸收供体菌（donor cell）的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的现象。
• 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。
• 感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。

第38页：转导

2、Transduction（转导）•转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。

第39页：普遍转导

普遍转导

• Generalized transduction（普遍转导）
• 定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。
• 媒介：温和噬菌体
• 方式完全普遍转导流产普遍转导

第40页：局限转导

局限转导

• Specialized transduction（局限转导）
• 定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。
• 缺陷噬菌体的形成方式：脱离宿主核染色体时，发生低频率的误切。

第41页：接合

接合

• 3、Conjugation（接合）
• 定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。
• 四种不同接合型菌株F+菌株（雄性菌株）F-菌株（雌性菌株）Hfr菌株（高频重组菌株）F’菌株

第42页：原生质体融合

4、原生质体融合（Protoplast fusion）•原生质体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。

第43页：有性杂交

5、有性杂交（Sexual hybridization）•有性杂交：不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。

第44页：准性杂交

6、准性杂交（Parasexual hybridization）•准性杂交：同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。

第45页：准性生殖与有性生殖的比较项目准性生殖有性

准性生殖与有性生殖的比较项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞形态相同的体细胞形态或生理上有分化的性细胞独立生活的异核体阶段有无接合后双倍体的细胞形态与单倍体基本相同与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径通过有丝分裂通过减数分裂接合发生的几率偶然发现，几率低正常出现，几率高

第46页：基因工程与克隆载体

七、基因工程（Gene engineering）•利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心----基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。

第47页：基因工程

基因工程

• 1、Genetic Engineering Procedures
• Isolation and fragmentation of the source DNA
• Joining the DNA fragments to a cloning vectorwith DNA ligase
• Incorporation into a host
• Detection and purification of the desired clone
• Production of large numbers of cells orbacteriophage containing the desired clone forisolation and study of the clone DNA

第48页：克隆

克隆

• Cloning Vectors---Plasmids
• Small, only 4361 BP, StableinE. coli
• High copy number (1000-3000 copies per cell)
• Easily isolated in thesupercoiled form
• Foreign DNA can beinserted in good amount
• Restriction sites are known
• Single cleavage sites forseveral restriction enzymes
• Two antibiotic resistancemarkers
• Transformation easyPlasmid pBR322

第49页：基因克隆

Gene cloning and Expressionusing Plasmid pBR322

第50页：克隆载体与宿主

克隆载体与宿主

• cloning vectors---Hosts
• Ideal hosts: rapid growth, capable of growth in cheapculture medium, not harmful or pathogenic,transformable by DNA, stable.
• Prokaryotic hosts:E. coli,Bacillus subtilis.
• Eukaryotic hosts:Saccharomyces cerevisiae.
• virusDNA virusSV40, a virus causing tumors in primates,can be used as a cloning vector into human culturelines.Retroviruses, vaccinia virus are useful too.Baculovirus, an insect DNA virus can be used totransfer DNA to insect cell lines

第51页：目的克隆的筛选

3、Finding the right clones(a) Detectingproduction ofprotein by use ofspecific antibody(b) Detectingrecombinantclones by colonyhybridizationwith radioactivenucleic acidprobe

第52页：

第53页：基因工程的应用

基因工程的应用

• 5、Practical Applications of GeneticEngineering
• Microbial fermentations: antibiotics, enzymes, proteins,biopolymers (PHA) etc.
• Virus vaccines: expression of virus protein coats.
• Mammalian proteins: cloning and expression of humanproteins in bacteria.
• Transgenic plants and animals: improve growth ratesand yields, as well as new properties for new species.
• Environmental biotechnology: clone new genes fordegradation of synthesized compounds.
• Gene regulation and gene therapy: antisense RNA,ribosymes, genetic engineering to treat genetic diseases

第54页：菌种的衰退、复壮与保藏

菌种的衰退、复壮与保藏

• 八、菌种的衰退
• 正变→菌种进化（个别）进化性变异负变→菌种衰退（大量）退化性变异
• 菌种衰退的表现1.菌落和细胞形态的改变；2.生长速度缓慢，产孢子越来越少；3.代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降；4.抗不良环境条件能力的减弱。自发突变

第55页：菌种衰退的防止1.控制传代次数

菌种衰退的防止1.控制传代次数

• •菌种衰退的防止
• 控制传代次数，采用有效的菌种保藏方法
• 创造良好的培养条件
• 利用不同类型的细胞进行接种传代

第56页：菌种复壮

• 菌种复壮
• 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施。
• 广义：在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。

第57页：菌种复壮的方法1.纯种分离

菌种复壮的方法1.纯种分离

• •菌种复壮的方法
• 纯种分离：平板表面涂布法、平板划线分离法、琼脂培养基浇注法
• 通过宿主体内生长进行复壮
• 淘汰已衰退的个体

第58页：菌种保藏

• 菌种保藏
• 斜面冰箱保藏法：将菌种接在适当的斜面上，待其生长丰满后，放入4℃冰箱中保藏。
• 半固体穿刺保藏法：将菌种接入半固体直立柱中，进行培养，待长好后，放入4℃冰箱中保藏。
• 石蜡油封存法：将无菌石蜡油加入到上述保藏菌种中，隔绝空气，则效果较好；如用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，则效果更好。

第59页：砂土管保藏法

砂土管保藏法

• 砂土管保藏法：取过筛（60目）河砂，用10%HCl浸泡，用水洗净后，烘干，再取瘦土，以4∶1混合，装入小试管，灭菌后，滴入几滴菌悬液，搅匀，抽气干燥，放入低温处保藏。
• 冷冻干燥保藏法：将用灭菌牛奶制成的高浓度菌液装入灭菌的安瓿瓶中，放入低温条件下抽气干燥，使其中水分因升华作用逸出，形成完全干燥的菌块，然后将安剖瓶在真空条件下融封。

第60页：

第61页：七种常用保藏方法的比较评价保藏期适宜菌种

七种常用保藏方法的比较评价保藏期适宜菌种主要措施方法简便约1-6月各大类低温（4℃）冰箱保藏法（斜面）简便约6-12月细菌酵母菌低温（4℃）避氧冰箱保藏法（半固体）简便约1-2年各大类低温（4℃）阻氧石蜡油封藏法较简便约10年细菌酵母菌低温（-70℃）保护剂（15-50%甘油）甘油悬液保藏法简便有效约1-10年产孢子干燥，无营养砂土保藏法繁而高效＞5-15年各大类干燥，低温，无氧，有保护剂冷冻干燥保藏法繁而高效＞15年各大类超低温（-196℃）有保护剂液氮保藏法

第62页：

第63页：

第64页：T2噬菌体感染宿主细胞

Infection of host cell by T2 phage

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第66页：

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第68页：

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第71页：突变株的分离

突变株的分离

• Isolation of Mutants
• Pigmented andnonpigmentedmutants
• Antibiotic-resistantmutants within theinhibition zone
• Genetic marker,such as theexpression of-galactosidase thatproduces the bluecolor

第72页：暗修复

暗修复

第73页：诱变剂量

诱变剂量

第74页：筛选方法

筛选方法

第75页：抗生素法

抗生素法

第76页：菌丝过滤法

菌丝过滤法

第77页：夹层培养法

夹层培养法

第78页：影印平板法

Replica Plating Technique: Isolation of Mutants

第79页：完全培养基与基本培养基

Complete mediumMinimal medium

第80页：逐个检出法

逐个检出法

第81页：生长谱法

• 生长谱法
• 方法简便；
• 回变和污染不影响结果
• 测定物质可为粉末或纸片测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；

第82页：转化

Transformation

第83页：转化过程（一）

Mechanism of transformation（一）

第84页：转化过程（二）

Mechanism of transformation（二）

第85页：转导

Transduction

第86页：完全普遍转导

Complete transduction（完全普遍转导）

第87页：

第88页：局限性转导

Specialized transduction

第89页：局限性转导

Specialized transduction

第90页：不同菌株间的接合

Conjugationbetween different bacteria

第91页：F质粒的结构

Structure of F plasmid

第92页：接合转移机制（一）

Mechanism of conjugative transfer ofplasmid DNA

第93页：接合转移机制（二）

Mechanism of conjugative transfer ofplasmid DNA

第94页：接合转移机制（三）

Mechanism of conjugative transfer ofplasmid DNA

第95页：

第96页：

第97页：原生质体融合

原生质体融合

第98页：准性生殖①菌丝联结②异核体形成（质配）③

• 准性生殖
• 菌丝联结
• 异核体形成（质配）
• 核配形成杂合二倍体
• 体细胞交换和单倍体化。

第99页：