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本课件为微生物学第七章「微生物遗传与育种」，先以转化、噬菌体感染和病毒重建三个经典实验确证遗传物质基础，继而说明原核与真核微生物基因组结构特点和质粒的类型与应用，随后系统讲解基因突变的规律机制与诱变育种流程、原核生物的转化转导接合及真核微生物的有性杂交与准性生殖，最后介绍菌种衰退复壮与保藏方法。
第七章微生物遗传与育种：讲述遗传变异的物质基础、基因突变与诱变育种、基因重组与杂交育种、基因工程概要，以及菌种的衰退、复壮和保藏。
遗传和变异是生命的最本质特性之一。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。
自发突变频率通常为 10-6～10-9。
微生物是遗传学研究中的明星：
第一节遗传变异的物质基础。一、三个证明 DNA 是遗传物质的经典实验。1、经典转化实验：肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae 分为两型——S 型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）与R 型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）。
1928 年，F. Griffith（格里菲斯）以肺炎链球菌作了三组实验，观察到 R 型活菌与加热杀死的 S 型菌混合注射后，可从体内分离出有致病性的 S 型菌，说明存在某种转化因子。
1944 年，Avery 精确重复了转化实验，确定了转化因子。实验证明，将 R 菌转化为 S 菌的转化因子是 DNA。
2、噬菌体感染实验：实验证明，进入细菌细胞内部的物质是 DNA。DNA 包含有产生完整噬菌体的全部信息。
3、植物病毒重建实验：实验证明，遗传信息的流向与 RNA 的传递是一致的。
源文件此处文字作「遗传信息的流向与RNA的传递是一的」，按教材通行表述应为「是一致的」，此处按标准表述整理，未改变原意。
二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式。（一）遗传物质在 7 个水平上的形式：
（二）微生物基因组结构的特点 1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组：
个别细菌（鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌）和古生菌的 rRNA 和 tRNA 中也发现有内含子或间插序列。
2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组：
原核生物和真核生物的基因组比较：从染色体形态、有无核膜、操纵子结构、内含子与重复序列等方面进行对照，详见本节图示。
（三）原核生物的质粒 1、定义：质粒（plasmid）是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。
2、结构特点：通常以共价闭合环状（covalently closed circle，简称 CCC）的超螺旋双链 DNA 分子存在于细胞中；也发现有线型双链 DNA 质粒和 RNA 质粒。
质粒分子的大小范围从 1 kb 左右到 1000 kb；细菌质粒多在 10 kb 以内。
4、质粒在基因工程中的应用。质粒的优点：
E. coli 的 pBR322 质粒是一个常用的克隆载体。
5、质粒的检测：
6、质粒的主要种类——按质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应划分：
第二节基因突变和诱变育种。一、基因突变：一个基因内部遗传结构或 DNA 序列的任何改变，可遗传，自发或诱变产生。
（二）突变率：每一世代中发生某一性状突变的几率。
（三）突变的特点：
（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明——三个经典实验：变量实验、涂布实验、影印实验。三者证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。
（五）基因突变及其机制：分为诱发突变与自发突变两大类，分别由外界理化生物因素与细胞内部背景因素引起。
1、诱发突变：利用物理、化学和生物的因素，提高突变率的人为作法。（1）碱基的置换：DNA 分子中某一碱基被另一碱基取代，包括转换与颠换。
基因突变的机制：主要包括碱基的置换与移码突变两类，详见本节图示。
（2）移码突变：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误。正常阅读框为连续的三个碱基一组；发生添加（+）或缺失（-）后，其后全部密码子的读框发生错位，产生错误的氨基酸序列。
2、自发突变：无人为因素下的低频率突变。原因：（1）背景辐射；（2）有害产物积累；（3）碱基错配。
（3）染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位。
（六）紫外线对 DNA 的损伤及其修复。1、光复活作用：UV 照射使 DNA 链上相邻的两个嘧啶形成嘧啶二聚体，阻碍复制与转录；经可见光激活的嘧啶二聚体光解酶可将二聚体拆开，恢复正常结构。
2、切除修复（暗修复）：由核酸内切酶识别并切除含损伤的寡核苷酸片段，再由 DNA 聚合酶Ⅰ填补缺口、DNA 连接酶封口，不依赖可见光。
二、突变与育种。
2、诱变育种的原则（1）使用简便有效的诱变剂：
诱变育种的原则：
3、突变株的筛选：
突变株的筛选方法：诱变 → 淘汰野生型 → 检出营养缺陷型 → 鉴定营养缺陷型。
Ames 试验：由美国加利福尼亚大学的 Bruce Ames 教授于 1966 年发明。具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）组氨酸营养缺陷型菌株（his-）的回复突变率。
回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。Ames 试验利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用。
证明 Ames 试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物「反应停」，由于其药效显著，在 60—70 年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用「反应停」。后来采用 Ames 试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。
但如果能在这种药物上市之前就进行 Ames 试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。
第三节基因重组和杂交育种。一、原核生物的基因重组。（一）转化：供体菌游离的 DNA 片段被受体菌摄取并实现遗传重组的过程。
1928 年，Griffith 发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。进行自然转化，需要两方面必要的条件。
1、建立了感受态的受体细胞。感受态细胞：具有摄取外源 DNA 能力的细胞。自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取 DNA 的能力，或人为地将 DNA 导入细胞内。
2、外源游离 DNA 分子（转化因子）。
转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）：外源双链 DNA 与受体细胞表面的结合蛋白结合，一条链被核酸酶降解，另一条链穿入细胞，与受体染色体同源区段发生重组交换而整合。
噬菌体 DNA 被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。转染（transfection）：提纯的噬菌体 DNA 以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后，产生完整的病毒颗粒。
转化过程的特点：
人工转化：用 CaCl2 处理细胞、电穿孔等是常用的人工转化手段。它是在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。
不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源 DNA 的「人工感受态」。质粒的转化效率高。
（二）细菌的转导（transduction）：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式，即一个细胞的 DNA 通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
细菌转导的类型：普遍转导（完全普遍转导、流产普遍转导）、局限转导（低频转导、高频转导）、局限转导与普遍转导的主要区别、溶源转变。
（三）接合（conjugation）：通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
1946 年，Joshua Lederberg 和 Edward L. Tatum 进行细菌的多重营养缺陷型杂交实验：中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。
证实接合过程需要细胞间的直接接触的「U」型管实验（Bernard Davis，1950）：U 型管底部以烧结玻璃滤板隔开，两侧分别培养两株营养缺陷型菌株，滤板允许培养液与小分子通过但阻留细胞，结果未出现原养型重组体，说明接合必须以细胞直接接触为前提。
接合机制（大肠杆菌的接合机制）：接合作用是由一种被称为 F 因子的质粒介导。F 因子的分子量通常为 5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的 20 多个基因。
F 因子为附加体质粒，既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上。
1）F+ × F- 杂交：理化因子的处理可将 F 因子消除而使 F+ 菌株变成 F- 菌株。F+ 菌株的 F 因子向 F- 细胞转移，但含 F 因子的宿主细胞的染色体 DNA 一般不被转移。
2）Hfr × F- 杂交：Hfr 菌株的 F 因子插入到染色体 DNA 上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给 F- 细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。
Hfr 菌株仍然保持着 F+ 细胞的特征，具有 F 性菌毛，并象 F+ 一样与 F- 细胞进行接合。所不同的是，当 OriT 序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F 因子的先导区结合着染色体 DNA 向受体细胞转移。F 因子除先导区以外，其余绝大部分处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此 F 因子不易转入受体细胞中。Hfr×F- 杂交后的受体细胞（接合子）大多数仍然是 F-。
染色体上越靠近 F 因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在 F- 中出现重组子的时间就越早，频率也高。
中断杂交（interrupted mating）技术：利用 Hfr×F- 的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间（分钟）为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。
大肠杆菌基因组很大（全部转移需要 100 分钟），其遗传图谱须用多株 F 因子整合在不同位置的 Hfr 菌才能完成。
3）F′ × F- 杂交：Hfr 菌株内的 F 因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的 F 因子，特称为 F′ 因子。
F′×F- 与 F+×F- 的不同：供体的部分染色体基因随 F′ 一起转入受体细胞——a）与染色体发生重组；b）继续存在于 F′ 因子上，形成一种部分二倍体。细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F 因子转导（F-duction），或 F 因子媒介的转导。
「接合」「转导」及「转化」这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：外源 DNA 的来源及进入途径有差异。
（四）原生质体融合：将不同遗传型的细胞脱去细胞壁制成原生质体，在聚乙二醇或电融合等促融条件下使两个原生质体融合，经细胞壁再生与染色体重组而获得重组体，可突破种属间的杂交障碍。
二、真核微生物的基因重组。（一）有性杂交：细胞（＋）与细胞（－）有性接合 → 染色体重组 → 新遗传型。能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交。
（二）准性杂交：细胞（＋）与细胞（＋）准性接合 → 基因重组 → 新遗传型。过程为：菌丝联结 → 质配 → 核配 → 有丝分裂交换 → 单倍体杂合子。
在半知菌类中最为常见，即半知菌的准性生殖。
准性杂交育种：利用半知菌的准性生殖过程，通过诱导异核体形成与杂合二倍体的有丝分裂交换、单倍化，获得具有优良性状组合的重组菌株。
第四节基因工程。特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性。
定义：在基因水平上改造遗传物质，从而使物种发生变异，创建出具有某种稳定新性状的生物新品系。
二、基因工程的基本操作：获得目的基因 → 选择基因载体 → 体外重组 → 外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）→ 筛选和鉴定 → 应用。
第五节菌种的衰退、复壮和保藏。性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡。
一、菌种的衰退与复壮。菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变。
纯菌种 →（自发突变）→ 不纯菌种 →（突变个体传代增殖）→ 原始个体 → 衰退菌种。菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状。
菌种的复壮：
二、防止衰退的措施：
三、菌种保藏。目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用。
基本原则：
基本方法：
冷冻干燥保藏法与液氮保藏法：前者将菌悬液与保护剂混合后迅速冻结并真空升华干燥，于低温密封保存；后者将菌种悬浮于甘油或二甲亚砜保护剂中，置于液氮（-196℃）或液氮气相中长期保存，二者均可显著延长菌种存活期并降低变异率。
2、细胞核水平：真核生物为细胞核内的核染色体；原核生物为核区 DNA 链构成的核基因组。在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质（如质粒）。
3、染色体水平：染色体是由组蛋白与 DNA 构成的线状结构。
4、核酸水平：
微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。
5、基因水平：基因是核酸分子上编码一个多肽或功能 RNA 的一段序列，是遗传信息传递与表达的功能单位。
6、密码子水平：mRNA 上每三个相邻核苷酸构成一个密码子，对应一种氨基酸或终止信号，是遗传信息翻译的基本单位。
7、核苷酸水平：核苷酸是最小突变单位和交换单位。
（1）致育因子（Fertility factor，F 因子）：又称 F 质粒，其大小约 100 kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。
携带 F 质粒的菌株称为 F+ 菌株（相当于雄性），无 F 质粒的菌株称为 F- 菌株（相当于雌性）。F 因子能以游离状态（F+）和以与染色体相结合的状态（Hfr）存在于细胞中，所以又称之为附加体（episome）。
（2）抗性因子（Resistance factor，R 因子）：包括抗药性和抗重金属两大类，简称 R 质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。
R 质粒由两部分组成：抗性转移因子（RTF）——转移和复制基因；抗性决定因子——抗性基因。
R100 质粒（89 kb）可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：
并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。
（3）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）：携带编码细菌素的结构基因、涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质基因，以及赋予宿主对该细菌素具有「免疫力」的相关产物的基因。
细菌素一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为 colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为 Col 质粒。
细菌素结构基因涉及：细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因；赋予宿主对该细菌素具有「免疫力」的相关产物的基因。
（4）毒性质粒（virulence plasmid）：许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。
毒性质粒的实例：
Ti 质粒中的 T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体。
（5）代谢质粒（Metabolic plasmid）：质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。
降解质粒：将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，在环境保护方面具有重要的意义。
假单胞菌具有降解一些有毒化合物的能力，如芳香族化合物（苯）、农药（2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D）、辛烷和樟脑等。
（6）隐秘质粒（cryptic plasmid）：隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。
在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）。
变量实验（fluctuation analysis）：Salvador Luria 与 Max Delbrück（1943）设计。通过对平行培养物与同一大培养物中抗性菌落数的方差比较，证明抗性突变在接触噬菌体之前即已自发产生。
二人因相关贡献获 1969 年诺贝尔生理学或医学奖。
变量实验（fluctuation analysis）示意：将少量菌液分别接入多支平行小管培养，与单支大体积培养物分别涂布于含噬菌体平板，比较两组抗性菌落数的波动程度，据以判断突变的自发性与发生时间。
Newcombe 的涂布实验（1949）：先在不含噬菌体的平板上培养一段时间使自发突变株形成微菌落，再用涂布棒重涂布一部分平板并继续培养，结果重涂布平板上抗性菌落数显著增多且分布均匀，进一步支持突变的自发性与不对应性。
影印实验（replica plating）：Joshua Lederberg 与 Esther Lederberg（1952）发明。用灭菌丝绒将母平板的菌落原位转印到一系列选择性平板上，可在从未接触选择因子的条件下检出抗性突变株。
J. Lederberg 于 1958 年获诺贝尔生理学或医学奖。
普遍转导（generalized transduction）：噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程。
普遍性转导的三种后果：
完全普遍转导：进入受体的外源 DNA 与受体染色体发生双交换而整合，随受体染色体一起复制并稳定遗传，形成稳定的转导子。
流产普遍转导：转导 DNA 不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有 DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，在选择培养基平板上形成微小菌落。
局限转导：温和噬菌体感染并整合到细菌染色体的特定位点上，宿主细胞发生溶源化。溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体 DNA 上，部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中。
低频转导：温和噬菌体 λ 裂解时的不正常切割可产生包含 gal 或 bio 基因的缺陷噬菌体。其 DNA 分子在宿主细胞内能够象正常的 λ DNA 分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力；感染受体细胞后，通过 DNA 整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。
低频转导裂解物中含正常噬菌体与极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒，在低感染复数下只产生极少量局限转导子。
高频转导：在低感染复数条件下形成含缺陷噬菌体与正常噬菌体的双重溶源菌，经诱导后缺陷噬菌体与正常噬菌体同步复制，经三次感染、三次整合、一次切割、两次复制、两次裂解、两次转导，得到高频转导裂解物——其中部分缺陷噬菌体与正常噬菌体等量，可在低感染复数下产生大量局限转导子。
局限转导与普遍转导的主要区别：
溶源转变是一个与转导相似又不同的现象：温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。
溶源转变的特点：
载体的特性：具有复制子、限制性内切酶位点、选择性遗传标记，可大量增殖。
常用载体：
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