13 第十三章 毛细管电泳.ppt

第1页：毛细管电泳概述

第十三章毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE )第一节概述早在一百多年以前,较原始的电泳实验,是在一个U形一管中进行的,管中盛有溶液,两端置有电极,加上几百伏电压后,首次实验了对毒素和抗毒素的分离。1909年,L.Michaelis提出“电泳”这一术语,他的实验是用于测定蛋白质的等电点。

第2页：早期电泳研究与稳定介质

此后,许多的研究报告涉及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了的溶液中,再次发生对流混合,曾使用了各种稳定介质,如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺;为了防止热扩散而使用了一种内径小的管道,管道内径由3mm缩小至75μm。1981年,Jorgenson.和Lukacs使用75μm内径的熔融石英毛细管,电泳分离氨基酸和肽。至此,出现了毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)技术。

第3页：毛细管电泳的特点

毛细管电泳,又称高效毛细管电泳(High Performance capillary electrophoresis,HPCE),它不同于经典的区带电泳,有如下特点:(1)它是在内径(10~200)μm的石英毛细管中进行的,在毛细管中的散热较好,沿着管截面的温度梯度很小,因此,可以提高加在毛细管两端的电压,所加电压可高达几十千伏。(2)它不需要阻流介质,但可使用凝胶作分子筛介质。

第4页：在柱检测与灵敏度

(3)可使用在柱检测法,缩短分析时间,结合计算机处理数据,可实现自动化操作。(4)灵敏度高,检测限可达(10-13~10-15)mol,使用激光诱导的荧光检测限可达(10-19~10-21)mol。(5)分辨率高,理论塔板数为几十万至几百万/米。(6)取样量少,有时只需几个纳升(nL,10-9L),流动相只需几毫升。

第5页：第二节高效毛细管电泳的基本原理

第二节高效毛细管电泳的基本原理

• 溶质在毛细管区带电泳过程中的传递含离子的溶液,在电场中所发生的物理过程服从欧姆定律,当有直流电通过溶液时,阴离子向阳极迁极,阳离子向阴极迁移,溶液的导电率取决于离于浓度和其迁移率(又称淌度,即指溶质在单位时间和单位电场强度下移动的距离)。离子迁移率以μ表示,其大小受溶质的电荷/离子大小比例所控制。

第6页：带电质点的电场力

在电场的影响下,带电荷的质点受到的力Fe,等于其净电荷q与电场强度E的乘积,即Fe=q×E。电场强度E以每单位长度所加的电压U来表示,即E=U/L,其中L是毛细管长度。Fe对正电荷为正值,对负电行为负值。电场力促使带电质点向两极移动,质点在移动过程中,也受到一种与电场力方向相反的阻滞力Fd,阻止其移动,此阻滞力与质点的电泳速度υ成正比,由下式结出

第7页：摩擦阻力与电泳速度

Fd=f×υ式中,f是质点平移动所受的摩擦阻力,对小的球状物质点,可用斯托克斯(Stokes)定律表示,即:f=6πηr式中,η是溶液的粘度,r是离子半径。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、质点大小和其电泳速度。由于存在摩擦阻力,一种带电质点在电场中运动,被加速到一有限速度,此速度取决于Fe和Fd,这一有限速度称为电泳速度,υep。当促进力与阻滞力达到平衡时,则

第8页：一种质点在每单位电场强度下的稳态速度

ep=q·E/f将上述表达式合并,作为电泳迁移率(或电泳淌度)μep。表示式,则μep=υep/E=q士/6πηr电泳迁移率定义为:一种质点在每单位电场强度下的稳态速度。

第9页：电泳迁移率的影响因素

ep值的大小,取决于分子的净电荷数及其摩擦性质,(分子大小和形状)以及所用介质的介电常数ε和粘度η。因而,对于每一种质点,在电场作用下的迁移均具有特定的速度。对于大分子或胶体,其关系可表示为

第10页：熔融石英毛细管的表面

HPCE分离,几乎都是在熔融石英毛细管中完成的,熔融石英是一种高度交联的SiO2聚合物,具有很好的抗拉强度。石英毛细管表面含有许多硅酸基(Si—OH),在一定的条件下可离解。使表面带有负电荷。由于表面带负电,因此,带负电荷的离子被表面排斥,而带正电均离子则被毛细管壁吸引。

第11页：双电层的形成

在毛细管壁的阴离子,与来自主体溶液中的阳离子在石英一溶液界面上形成双电层。由于静电场的作用,靠近表面的那些抗衡离子是不迁移的,因此构成所谓稠密层。由于热运动关系,离表面远的离子构成可迁移层或扩散层,因为在双电层内离子的立体分布,就形成一种电势梯度.

第12页：毛细管双电层与Zeta电势

第13页：电渗流的形成

当在毛细管两端加有电场时;扩散层内可迁移的阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的,因此,在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道,向阴极移动,形成一种液流,称之为电渗流(electroosmoticflow,EOF),它是一种电泳驱动力。在双电层内,EOF总是向双电层内抗衡离子方向迁移,穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速度所控制。电渗流的线速度υeo,可以定义为:

第14页：Zeta 电势表达式

Zeta电势可表示为:ξ=4πδρ/ε式中,ρ是毛细管表面电荷密度;δ为双电层厚度。按近代电解质理论,δ等于1/K,因此式可写为:

第15页：迁移时间与分离效率

第三节在CZE分离中的迁移时间、效率及分辨率在电渗流存在下,离子的迁移速度可表示为:υ=(μ±μeo)U/Lt式中,Ld是毛细管总长度;U是外加电压。离子的迁移时间为t,则t=Lt×Ld/(μ±μeo)·U式中,Lt为进样端到检测器之间的毛细管长度,或称为迁移长度。分离效率n可表示为

第16页：式中,D为溶质的平均扩散系数

式中,D为溶质的平均扩散系数。由上式可见,如果热影响阿忽略不计的话,增大电压,可增加分离效率。按Gidding方程[5],分辨率R只可定义为

第17页：电渗流对迁移顺序的影响

1和μ2两溶质的电泳迁移率,而μ是它们的平均电泳迁移率。在许多情况下,电渗流速度比许多质点的电泳速度要快,因此,在毛细管中的所有溶质将朝一个方向迁移,不管它们带多少正电荷,都将先被检出,继之中性质点被检出,最后带负电荷的质点被检出。如下图所示。

第18页：毛细管电泳分离效率

第19页：HPCE 仪器结构

第四节HPCE仪器的基本结构HPCE仪器的基本结构如下页图所示。充满缓冲液的毛细管,两端分别浸入盛有缓冲液的储瓶中,之后通以30kV的电压,整个带电管路置于一个安全保护盒内以防高压危险,打开有机玻璃盒时即自动切断电源。待测组分从毛细管的一端引人,在电场作用下,由于离子迁移速度有差别,而在整个毛细管内形成不同的样品区带,在毛细管的另一端放置检测器,以便连续地检测流过的每一个组分带,分析信号通过检测器接收后。经放大再输入计算机系统进行数据处理与储存。

第20页：HPCE仪器基本结构