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本课件围绕遗传信息传递的中心法则展开，依次讲解DNA的半保留复制与酶学、DNA损伤修复、转录与RNA聚合酶、遗传密码与蛋白质生物合成及翻译后加工，最后介绍基因工程的工具酶与基本流程。
分子生物学(分子遗传学)中心法则反映了从DNA→RNA→蛋白质的遗传信息主流，揭示了生物体内遗传信息的贮存、传递和表达的规律。转录RNA翻译蛋白质DNARNA （病毒）复制复制翻译蛋白质（病毒）反转录
一、DNA的半保留复制2.半保留复制的实验证据:1.定义：1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。以亲代DNA双链为模板以碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。
DNA半保留复制DNA的复制的方式------1958, Messelson and Stahl实验证实
细菌的DNA双链(蓝线的代表含15N)含15N-DNA的细菌培养于普通培养液第一代重DNA普通DNA普通DNADNA半保留复制的证据可排除全保留式Why?
混合式重DNA普通DNA重DNA第二代半保留式第一代故可排除混合式复制方式
培养第一代结果重DNA普通DNA母链全保留式半保留式混合式重DNA普通DNA排除全保留式
细菌的DNA双链(蓝线的代表含15N)(红线的代表含14N)含15N-DNA的细菌培养于普通培养液继续培养于普通培养液第二代重DNA第一代重DNA普通DNA普通DNADNA半保留复制的证据排除混合式Why?
DNA的半保留复制的生物学意义：→DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。→DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。
；必须具备的基本条件模板：母链DNA原料：dNTP(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP) 酶和蛋白质因子：引物：一小段RNA 能量（ATP）及某些无机离子
参与DNA复制的酶类与蛋白质因子及其主要作用1. 拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）无ATP时：作用相当于TopoⅠ,但切割的是双链DNA某一部位(断双链)。有ATP时：使带断口、松弛状的DNA分子旋紧转变成负超螺旋结构，再连接断端。不需耗能(ATP)，切割(断)双链DNA中的一链，松解螺旋, 封闭切口。又称切割封口酶。TopoⅠ 的作用TopoⅡ(又称旋转酶)的作用
2. 解链酶(又称解螺旋酶或螺旋酶,helicase)解链酶作用：断裂互补碱基间的氢键,使DNA双链分离形成“复制叉”。
ABC拓扑异构酶II+ATP拓扑异构酶IDNA的松弛状态与超螺旋
3. 单链DNA结合蛋白(DNA结合蛋白)(single stranded DNA-binding protein,SSB)作用：防止重新形成双链和防止单链模板被核酸酶水解,维持DNA单链状态和完整性
4.引物酶(Primase)5´3´5´RNA引物5´5´RNA引物3´RNA的合成：需引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。DNA不能从无→有合成，需在一小段RNA基础上合成DNA
5. DNA聚合酶（DNA polymerase, DNA pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）原核生物（E.coli）迄今已知只有3种：DNA polⅠ、DNA polⅡ、DNA polⅢ。真核生物亦发现有多种DDDP：DDDP、、、、。其性质与功能见表13-1和表13-2
；原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP dCTP dTTP)；需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。；需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含3’-OH. (一) DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：
大肠杆菌（E.coli）中迄今已知有 3 种依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶（DDDP）：DNA pol Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其性质与功能如下表。
| 性质 | DNA聚合酶Ⅰ | DNA聚合酶Ⅱ | DNA聚合酶Ⅲ |
|---|---|---|---|
| 酶分子/细胞 | 400 | 40 | 20 |
| 酶分子量(kd) | 109 | 90 | 140 |
| 5'→3' 聚合功能 | 有 | 有 | 有 |
| 5'→3' 外切酶活性 | 有 | 有 | 无 |
| 3'→5' 外切酶活性 | 有 | 有 | 有 |
| 聚合核苷酸数/分钟/分子(37℃) | 1000 | 50 | 15000 |
| 主要功能 | 修复等 | 修复作用 | 复制 |
表13-2 真核细胞中DNA聚合酶的性质───────────────────── DNA聚合酶性质-------------------------------------------------------α β γ δ ε ───────────────────── 分布细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核分子量(kd) >250 36-38 160-300170 256 3’→5’外切酶活性无无有有有5’→3’聚合作用有有有有有主要功能复制损伤修复复制复制复制,损伤修复(随从链) (领头链) ─────────────────────
DDDP 5´→3´聚合作用示意图3´模板链5 ´5´3´
DDDP 的5´→3´外切及3´→5´外切作用示意图3´→5´外切5´→3´外切5´3´CA3´
6. DNA连接酶(DNA Ligase)作用：在有模板指导的条件下，催化2个DNA片段(两片段间的距离为1个3',5'-磷酸二酯键的键长)的连接。原理：在一个DNA片段的3'-OH末端和另一个DNA片段的5'-P末端形成3',5'-磷酸二酯键，从而实现连接。特点：原核细胞:需辅助因子NAD+真核细胞:不需辅助因子NAD+,但需耗能(ATP)
表13-4参与DNA复制的酶及蛋白质───────────────────── 酶或蛋白质主要作用───────────────────── 拓扑异构酶类克服解链时打结及缠绕、松驰或引进负超螺旋解链酶类解开DNA双链单链DNA结合蛋白维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物DNA聚合酶ⅢDNA复制DNA聚合酶Ⅰ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接─────────────────────
（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图
DNA的复制过程复制的起始链的延长复制的终止
复制的起始1.在拓扑异构酶、解链酶及单链DNA 结合蛋白的共同作用下，DNA解旋、解链，形成复制叉。2.依赖于单链模板，由引物酶催化按碱基配对规律合成一小段RNA引物(原核细胞引物长50-100个碱基，真核约10个碱基)。
DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）→复制的终止：→复制的起始1、起始复合物的形成：称为引发2、RNA引物的合成→链的延伸：
复制起始阶段的特点真核细胞：具有多个起始位点原核细胞：仅有一个复制起始位点，但往往是双向复制
链的延长；引物合成后，由DNA polⅢ（真核细胞为DNA聚合酶或)催化，在引物3'-OH末端逐一添加与模板链对应互补的脱氧核苷磷酸,使新合成的链不断延长。领头链:链的延长方向(5'→3')与解链方向(复制叉移动方向)相同, 为连续合成。随从链:链的延长方向(5'→3')与解链方向(复制叉移动方向)相反，为不连续合成。；分段合成的DNA片段, 最初被命名为冈崎片段
或领头链III
三、DNA复制的半不连续性前导链滞后链冈崎片段前导链：以3’→ 5’方向的亲代链为模板连续合成的子代链。滞后链：以5’→3’方向的亲代链为模板的子代链先逆复制叉移动方向合成冈崎片段，再连接成滞后链。
复制的终止1.水解引物及填补空隙冈崎片段合成后，由DNA polⅠ(真核细胞可能是DNA聚合酶)水解去除RNA引物，并填补留下的空隙(5'→3')聚合。2.完整双链DNA分子的形成填补空隙后，DNA片段与片段之间还有一个缺口(一个3',5'-磷酸二酯键的长度), 由DNA连接酶催化连接成完整的链，从而产生完整的双链DNA分子。
DNA复制的精确性（高保真复制）1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍。3、DNA的损伤修复系统。DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制1000～10000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：
二、反转录(reverse transcription)概念以RNA为模板，dNTP为原料，反转录酶催化，按碱基配对规律合成DNA的过程。反转录酶, 又称为依赖RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase, RDDP) DNA转录RNARNA(病毒)反转录
....................RDDP引物, 4种dNTPRDDPRNase H4种dNTPRDDP或DDDP病毒RNARNA-DNA 杂化分子cDNA前病毒(双链DNA)酶催化反应示意图
反向转录酶存在于所有致癌RNA病毒中,其功能可能与病毒的恶性转化作用有关;但它也存在于某些正常细胞中，在细胞分化与胚胎发生中可能起某些作用。反转录病毒和反转录酶的发现,提出了一个重要的医学问题──病毒致癌及癌基因反转录的医学意义
反转录的医学意义癌基因(oncogene):能在体外引起细胞恶性转化,在体内诱发肿瘤的基因.细胞癌基因(c-onc)或原癌基因(pro-onc): 存在于生物正常细胞基因组中的癌基因. 正常情况下基因处于静止或低表达的状态. 当受到致癌刺激被活化并发生异常时则可发生细胞癌变. 病毒癌基因(v-onc): 存在于致瘤病毒中的能使靶细胞发生恶性转化的基因.用三个小写字母表示癌基因名称,如myc, fos, ras, src等
抑癌基因: 是一类抑制细胞过度生长,增殖从而遏制肿瘤形成的基因.如Rb,P53,P16等癌基因与抑癌基因之间一般处于动态平衡状态是一种反转录病毒, 可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS,艾滋病).反转录酶在基因工程,分子病的基因治疗方面也有重要作用.人类免疫缺陷病毒(HIV)反转录的医学意义
ONHNOCH3RPONHNOCH3RONHNOCH3RPNHNOROCH3UV引起DNA损伤的因素紫外线(常产生嘧啶二聚体) 电离辐射(断磷酸二酯键)物理因素胸腺嘧啶二聚体的产生
第二节DNA的损伤与修复一、DNA的损伤生物体受某些理化和生物等外源性因素或机体内环境改变的影响，引起DNA分子结构的任何异常改变称为DNA损伤(DNA damage)概念
化学因素：均能干扰复制与转录功能▲烷化剂：(如氮芥类, CTX)，使鸟嘌呤的N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点▲亚硝酸盐：使碱基脱氨原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配C→UA→IG→X
COHNCCHCHNOUCONCCHCHNNH2CANNH2NNNNOHNNNINOHNNNHH2NGNOHNNNHHOX
化学因素：均能干扰复制与转录功能▲烷化剂：(如氮芥类, CTX)，使鸟嘌呤的N7烷基化后脱落，成为无鸟嘌呤的位点▲亚硝酸盐：使碱基脱氨原G-C配对最终变为A-T配对，导致错配C→UA→IG→X▲丝裂霉素：与DNA共价连接引起链交联
目前多指病毒糖苷键自行断裂；自发脱氨基作用, C→U，A→I。生物因素生理因素机率极低突变(mutation)：有机体基因组可遗传的改变，即DNA序列的改变.根据引发的原因，可将突变分为：诱发突变和自发突变。
缺失根据DNA分子的改变，突变可分为4类：点突变颠换：异型碱基间变异,转换：同型碱基间变异,缺失或插入的碱基数不是3的整倍数时，则引起移码突变插入倒位(或易位)
DNA复制过程所发生的突变(碱基配对错误)，由核内DNA聚合酶Ⅰ以其校读功能予以纠正.若碱基错配频频发生或损伤范围大，则需采用以下修复方式进行修复.二、DNA损伤的修复
TT光复活酶（可见光）T + TDNA修复方式1. 光修复:2.切除修复：由3种酶共同参与完成。特异性核酸内切酶DNA pol IDNA连接酶5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'
5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'复制重组DDDP IDNA连接酶重组修复过程3.重组修复：亦称复制后修复
4. SOS修复：DNA分子受到较大范围的损伤，细胞对危急状态所作出的反应。机制引起DNA较长期的、广泛的突变。SOS调节网诱导产生的DNA聚合酶特异性低，识别碱基能力差,使修复部位仍存在较多错配的碱基，但细胞能继续生存。后果
一、转录（一）概念在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA的模板链为模板，4种NTP为原料，按碱基配对规律(T-A,A-U,G-C)合成一条与模板链互补的RNA链的过程。
真核生物DDRP的种类与功能种类存在部位转录产物对鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁45S rRNA 不敏感RNA聚合酶Ⅱ核质hnRNA和snRNA 极敏感RNA聚合酶Ⅲ 核质tRNA和5S-rRNA 中度敏感DDRP无3’→5’外切酶活性, 有什么结果?
⒉ρ因子(Rho factor)功能(1)能帮助DDRP识别终止信号并停止转录(2)具有ATP酶和解链酶活性，使RNA-DNA杂化分子解链，从而释放转录产物RNA分子
为何称模板链为反意义链，编码链为有意义链？可从下图理解：５'…GCA GTA CAT GTC …3 '编码链3 '…CGT CAT GTA CAG …５'模板链DNA转录５'…GCA GUA CAU GUC …3 'mRNA翻译N … 丙－缬－组－缬… C 肽比较编码链和RNA 链的碱基序列可见，除了以Ｕ代Ｔ外，其余均一致。基因组序列均以编码链(正链)表示.
1. 启动子（promoter）RNA 聚合酶与模板DNA结合的特定部位，是基因转录的开始部位。一般可分为两类DDRP 能直接识别的启动子需蛋白质辅助因子的帮助，DDRP 才能识别的启动子（四）启动子及终止信号确保转录精确而有效地起始的DNA序列
编码链5 '3 '启动子5 'MeGPPPRNA产物原核生物启动子转录起始部位+1基因转录区-10区TATAAT Pribnow 盒结合部位TGTTGACA -35区识别部位DNA模板链3 '5 '
编码链5 '3 'DNA模板链3 '5 'CCAAT CAAT盒-70真核生物启动子RNA产物转录起始部位+1基因转录区TATA TATA盒-25Hogness盒结合部位GAGCCACCCGC盒(少数)
2. 终止信号(终止子)DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的特定碱基序列。原核生物终止信号碱基组成特点有反向重复序列决定转录产物的回折形成茎-环(或称发夹)结构AT富集区GC富集区
反向重复序列AT富集区GC富集区一般认为由终止子引导的转录终止是不依赖ρ因子的
1. 转录起始形成转录空泡（DNA解链长约20bp)DDRP(σ亚基)辨认并结合于启动子部位由DDRP催化，头2 个NTP直接在起始点形成第一个磷酸二酯键(不需引物，由模板指导), 形成转录起始复合物σ亚基脱落（参与下一轮转录）由核心酶(α2ββ')催化链的延伸第一个总是GTP全酶( σα2ββ')-DNA模板(启动子)-pppGpN'-OH
3 '5 'DNA5 '3 'DNA起始点RNA聚合酶pppGpppN'pppN''5'pppGpN'转录起始时pppGpN-OH的生成CN3 '5 '模板链`CN3 '5 '模板链进一步延长起始
3. 转录终止；不依赖于因子的终止见前述因子的功能及右图依赖因子的终止作用机理
l作用机理：终止信号区特殊碱基序列决定RNA形成发夹形二级结构，这是阻止转录继续向下游推进的关键；lRNA-DNA杂化双链不稳定因素：DNA复性，RNA自身形成双链；RNA3'端，连续多个不稳定的rU：dA 碱基配对，使转录复合体解体。不依赖因子的终止
转录过程
RNA蛋白质蛋白质RNADNA复制复制反转录转录翻译翻译遗传信息传递的中心法则
蛋白质的生物合成
一蛋白质生物合成体系；一、mRNA（messenger RNA）——蛋白质生物合成的直接模板DNAmRNA蛋白质
一、mRNA*mRNA分子中每三个相临碱基组成一个密码子，代表一种氨基酸，或起始信号，或终止信号。*mRNA上的四种碱基可组成64(43)个密码子，其中61个代表不同的氨基酸，其余三个代表终止信号。
通用遗传密码子
l遗传密码的5个特点：.1. 通用性：从简单生物到人类使用同一套密码子。.2. 方向性：mRNA中密码子的阅读方向是5′→3′。由此可推测所有生物来源于一个共同的祖先。.3. 简并性：除Met，Trp外，其余氨基酸由2个以上密码子编码。同义密码子（但每一个密码子仅对应一个氨基酸）生物学意义：保证属的稳定性。
.4. 连续性：密码子的排列是连续的，不间隔，也不重叠。5′…. UCACGACAUAUG….3′5′….UCAGCGACAUAUG….3′丝精组蛋丝丙苏酪5′…. UCAGACAUAUG….3′丝天异亮*移码突变是最严重的突变！插入缺失
.5.起始密码子与终止密码子：起始密码子：AUG，GUG，UUC。终止密码子：UAA，UGA ，UAG。单顺反子：真核生物中，一条mRNA链只能为一种蛋白质编码。多顺反子：原核生物中，一条mRNA链往往为功能相关的几种蛋白质编码。
氨基酸臂反密码子环二、tRNA（transfer RNA）—蛋白质生物合成的“高级搬运工”
ltRNA的功能：·活化氨基酸，跨越能障，使肽键的形成变得容易。¶特定的tRNA搬运特定的氨基酸，保证了遗传信息传递的准确性。¸将密码子信息转换为对应氨基酸的符号——接合体，接合器，适配器(adaptor)等。即tRNA能与专一的氨基酸结合并识别mRNA分子上的密码子.
ltRNA上的反密码子识别mRNA上的密码子遵循不稳定或摆动（wobbling）配对原则。*一种tRNA仅转运一种氨基酸，而一种氨基酸可由几种tRNA转运。ACG5′3′5′3′UGUmRNAtRNA反密码环反密码子的第一碱基密码子的第三碱基UA或GIU,C或AGC或U
*在大肠杆菌中,与Met特异结合的tRNA有两种：tRNAfMet和tRNAMetCH3SCH2CH2CHH2NCOOtRNAfMet转甲酰基酶N10-CHO-FH4CH3SCH2CH2CHH-C-HNCOOtRNAfMetO+Met-tRNAMet上的Met则不被甲酰化！tRNAiMet: 真核细胞中起始tRNA,不被甲酰化
三、核糖体（ribosome）——蛋白质生物合成的场所l组成、结构与功能特点：.1. 结构复杂而精密由3种的rRNA（占60%左右）及数十种蛋白质组成。.2. rRNA起着主导的作用，蛋白质协助维持rRNA的功能区域。.3.转肽酶是RNA而不是蛋白质。
四、参与蛋白质生物合成的其他组分31. 氨基酰tRNA合成酶32. GTP，ATP33. 起始因子（IF）34. 延长因子（EF）35. 释放因子（RF）……或称为终止因子（TF）
第二节蛋白质生物合成过程一、氨基酸的活化与转运二、多肽链的形成—核糖体循环三、翻译后加工
一、氨基酸的活化与转运氨基酰tRNA 合成酶ATPPPiH2N-CH-C-OHR OH2N-CH-C-AMP-ER OH2N-CH-C~O-ACC-tRNAR O氨基酰tRNA合成酶高度特异性氨基酰tRNA 合成酶tRNA氨基酸tRNA消耗2个高能磷酸键
二、核糖体循环（ribosome cycle）活化氨基酸在核糖体上缩合形成多肽链的过程1. 起始2. 肽链延长3. 终止
(一) 起始阶段起始氨基酰-tRNA 与mRNA 结合到核糖体上,形成起始复合物的过程原料：fMet-tRNA，IF(1，2，3)，GTP，Mg2+1. 小亚基识别并结合mRNA30S50S50S+mRNA解聚30S*小亚基识别并结合mRNA起始密码子上游10nt富含嘌呤碱基的SD序列，IF3加固这一作用。IF-1IF-3小亚基的16S rRNA 3′端的UCCU序列
2. fMet-tRNAfMet与小亚基结合fMetIF-2，3. 大小亚基聚合IF-3GDP+Pi50S起始复合物GTPAUGAUGfMetAUGfMetAUGfMetIF-1IF-2
（二）肽链延长阶段：原料：各种氨基酰-tRNA，EF（Tu,Ts,G），GTP，Mg2+，K+。1. 进位Tu-GDPGDPTsTu-TsTu-GTPGTPPiTu-GTP特异的氨基酰-tRNA进入A位pAAUGAUGTu-GTP
2. 转肽Mg2+，K+转肽酶CH2CH2-CHOC=OCH-RNH2O=OCH2NCH3SAUGUAC给受OCO =R-CHNHOHCO=H3CSCH2CH2-CHNH2AUGUAC给受
3. 移位OHEFG，GTPAUGA215′→3′OH21AUG5′3′AUG213AUG312AUG213进位转肽移位转肽N→C延长
通过进位-转肽-移位不断重复，肽链自N→C端不断延长OHEFG，GTPOHA每生成1个肽键，要消耗2分子GTP(进位和移位), 而氨基酸活化需消耗2个高能磷酸键，每增加1个氨基酸残基实际消耗4个高能磷酸键
*真核生物与原核生物核糖体循环的肽链延长阶段的不同点：.1. 进位时延长因子是EF-1，可分为、和三类；.2. 移位时延长因子为EF-2，其活性可被白喉毒素抑制
三、终止阶段RF-3：促使RF-1或RF-2从核糖体上结合*真核生物仅有一个释放因子：eRF，可识别三种密码子, 并需GTP参与。RF-1：UAA，UAGRF-2：UAA，UGA当mRNA的任一终止信号进入A位时，没有任何tRNA能与之识别，只有释放因子(RF)识别这种信号, 进入终止阶段.
1. 终止密码子的辨认RF-1或RF-2UAAOCO =R-CHAUAAOCO =R-CHUAARF
H-OH转肽酶2. 肽链的水解和脱落OHRFCO =R-CHORFR-CHC-OHO =
3. tRNA、RF、mRNA的释放，核糖体大小亚基的解聚OHRF-3，IF-3EF-GRFOHRF
核糖体循环：fMetAUG1. 起始2. 肽链延长3. 终止
三、多核糖体5′3′意义：提高翻译效率。同时结合到同一条mRNA上多个成串的核糖体
四、翻译后加工（一）切割（二）修饰（三）新生肽链的折叠1. 去除N末端蛋氨酸残基2. 信号肽及其他肽段的切除1. 二硫键的形成2.辅助因子的连接和亚基聚合3. 多肽链中个别氨基酸的修饰
四、翻译后加工（一）切割原核生物1. 去除N末端蛋氨酸残基脱甲酰基酶Met-fMet-氨基肽酶真核细胞
2. 信号肽及部分肽段的切除l分泌性蛋白前体的两个特点：o1. N端含有信号肽（signal peptide）信号肽富含疏水氨基酸，其作用是使新合成的多肽链易于穿过膜系统，随后被信号肽酶切除。o2. 往往还含有一段与活性无关的其他肽段，必须将其切除才能形成有活性的蛋白质。
胰岛素的前体胰岛素切去C肽段C肽段A肽段B肽段
l分泌性蛋白穿过膜系统的两种机制o1. 分泌性蛋白在信号肽的介导下直接穿透膜系统小亚基大亚基信号肽内质网膜内侧
（二）修饰.1. 二硫键的形成CysSHCysSHCysSCysS-2H二硫键异构酶等
.2.辅助因子的连接和亚基聚合o蛋白质与糖、脂类、核酸、血红素等辅助因子结合形成糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、血红蛋白等结合蛋白质。o具有四级结构的蛋白质需进行亚基之间的聚合。如血红蛋白4个亚基的聚合。
.3. 多肽链中个别氨基酸的修饰o磷酸化：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸o羟基化：脯氨酸，赖氨酸o酰基化：组氨酸o甲基化：色氨酸o核糖基化：精氨酸意义：或者是蛋白质所固有的，或者在调节蛋白质功能时起重要作用。
（三）新生肽链的折叠（folding）*蛋白质的生物活性不仅依赖于他们的氨基酸顺序，而且依赖于他们的空间结构。*新生肽链必需经过一系列严格而复杂的折叠过程，才能形成具有正确空间结构的有活性的蛋白质。*多肽链的氨基酸顺序如何决定蛋白质的空间结构——第二遗传密码？——中心法则研究中有待解决的重大问题补充内容
*新生肽链的折叠需要分子伴侣和折叠酶类的参与`分子伴侣（molecular chaperone）：帮助新生肽链进行非共价折叠的一类蛋白质。如：热休克蛋白，前导肽等`折叠酶（foldase）类：目前只有两个：1. 二硫键异构酶(PDI)，2.脯氨酰异构酶(PPI)。催化与折叠直接有关的化学反应的酶。
分子伴侣帮助新生肽链正确折叠分子伴侣新生肽链正确折叠的蛋白质错误折叠的蛋白质
基因工程基本原理一、基因工程的定义及主要内容二、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定三、克隆基因的表达四、基因工程的成就和展望
；主要步骤：1、构建DNA重组分子2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定3、基因的表达一、基因工程定义及主要内容
返回基因工程基本程序真核染色体DNA克隆载体（质粒）限制酶切割限制酶切割并分离所需片断重组载体细菌宿主细胞的转化细胞分离培养增值
工具酶；限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶；DNA连接酶（DNA ligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymeraseⅠ）、末端转移酶（terminal transferase）、逆转录酶（reverse transcriptase）、核酸酶S1（nuclease S1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ）
限制性核酸内切酶；能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶→分布：主要在微生物中。→特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。→结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。→举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
几种限制性内切酶的作用位点
几种限制性内切酶的作用位点
目的基因的制备：逆转录法
目的基因的制备：逆转录法；用逆转录法合成cDNA的主要问题是：1、mRNA必需提得很纯2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物，3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的ds－cDNA，这与实验技术有关。
用限制酶切法直接从染色体DNA中分离；此方法主要适用于制备原核基因；对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出来；鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部DNA片段插入到载体DNA（如pBR322）中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的DNA片段。
用限制酶切法直接从染色体DNA中分离；此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。；此方法的缺点是：由于含有插入顺序，原始转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序切除，以形成成熟转录本，因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。
用PCR方法扩增目的基因片段；PCR是聚合酶链反应的缩写；是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术；在有少量DNA模板、引物、四种dNTP、TaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制DNA变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的DNA链，新合成的DNA链又可作为下一轮循环的模板。理论上经n次循环后，DNA链可达2n
用PCR方法扩增目的基因片段
克隆载体
克隆载体；常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒；质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链DNA。质粒具有复制能力，它的存在与否一般对细菌的生存没有决定性影响。；λ噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其DNA中的1/3对噬菌体的生长并非绝对需要，因此可被外源性DNA所替代，同时它可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于23kb
粘性末端连接法；用同一种或两种限制酶去消化载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用DNA连接酶将断端封口，即可获得重组DNA分子。；用同一种限制酶处理外源DNA和载体，重组时可导致外源DNA特别是质粒的自我环化；用碱性磷酸脂酶（不处理外源DNA分子）处理粘性末端的5‘磷酸基，能促使载体与外源DNA分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞内可被修复
返回磷酸脂酶能防止载体的自我环化
返回用两种限制酶处理载体也可防止环化
钝性末端连接法；用前述的化学合成法、逆转录法获得的DNA或cDNA片断，以及某些限制酶切生成的DNA片断，均为钝性末端，可用T4DNA连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接：1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源DNA分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体
钝性末端连接法返回末端转移酶处理退火
插入灭活法；目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。
返回插入灭活法限制酶切转化含四环素TA＋T
插入灭活法；目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNA的某一抗药基因上并在此插入外源DNA时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。
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