09 第九章 紫外-可见分光光度法.pptx

第1页：第九章紫外-可见分光光度法封面

紫外-可见分光光度法

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第2页：Ultraviolet Light

Ultraviolet Light (200～380nm)+Visible Light (380～800nm)

第3页：Ultraviolet &

Ultraviolet & VisibleSpectrophotometry (UV-Vis)

第4页：紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法

• 四大光谱之一
• 灵敏度较高(10-6g/ml)
• 应用广泛
• 定量分析(定性鉴别,结构鉴定)

第5页：对乙酰氨基酚

• 对乙酰氨基酚
• 阿替洛尔
• 青蒿素
• 鱼肝油
• 维生素A、维生素B2、维生素B12
• ……

第6页：“Inmanyapplications

“Inmanyapplications,othertechniquescouldbeemployedbutnonerivalUV-Visspectrophotometryforitssimplicity,versatility,speed,accuracyandcost-effectiveness”.——Principles of Instrumental Analysis

第7页：Whatis UV-Vis

• Whatis UV-Vis spectrophotometry?
• Basic principlesof UV-Vis?
• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?

第8页：Whatis UV-Vis

• Whatis UV-Vis spectrophotometry?
• Basic principlesof UV-Vis?
• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?

第9页：样品II0透光率

样品II0透光率(transmittance, T)T=II0透射光强入射光强

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第10页：样品吸光度

样品吸光度(absorbance, A)II0A=-lgT =-lgII0

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第11页：吸收光谱

吸收光谱(absorption spectrum)λ1λ1λ(nm)吸光度(A)λ1λ2λ3λ4λ5λ6…λnλ1λ2λ3λ4λ5λ6…λnλ1λ2λ3λ4λ5λ6…λn

第12页：末端吸收

末端吸收(endabsorption)肩峰(shoulder peak)吸收峰(peak)谷(valley)

第13页：Whatis UV-Vis

• Whatis UV-Vis spectrophotometry?
• Basic principlesof UV-Vis?
• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?

第14页：样品II0?

样品II0?

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第15页：AbsorptionIncoming

AbsorptionIncoming photon isabsorbed by the atom

第16页：σorbitalσ*orbitalπ

σorbitalσ*orbitalπorbitalπ*orbitaln (p) electron

第17页：Electronic

Electronic transitionsσ→σ*>n→σ*π→π*>n→π*anti-bondingσ→σ*π→π*n→π*n→σ*σπnπ*σ*anti-bondingbondingnon-bondingbondingE

第18页：电子跃迁类型与吸收峰位

跃迁类型峰位强弱分子基团举例σ→σ*<150nm弱饱和烃类CH3-CH3(λmax=135nm)n→σ*-200nm较强含-OH,-NH2 CH3Cl-X,-S等(λmax=215nmε=140)π→π*-200nm强含不饱和键CH2=CH2分子(λmax=165nmε=10-4)n→π*200-400nm较弱含有杂原子丙酮不饱和基团(λmax=279nmε=10-30)

电子跃迁类型表（跃迁类型、峰位、强弱、基团、举例），仅首行完整，建议对照原图人工还原。

第19页：常用术语生色团

常用术语生色团(chromophore)

有机化合物分子结构中含有π→π*或n→π*跃迁的基团，能在紫外可见光范围内产生吸收的原子团。(如–C=C–)助色团(auxochrome)：含有非键电子的杂原子饱和基团，当它们与生色团或饱和烃相连时，能使该生色团或饱和烃的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加的基团。(如–OH,–X)

第20页：红移(red shift)：亦称长移

红移(red shift)

亦称长移，由于化合物的结构改变，如发生共轭作用，引入助色团以及溶剂改变等，使吸收峰向长波方向移动。蓝(紫)移(blue shift)：亦称短移，当化合物的结构改变或受溶剂影响使吸收峰向短波方向移动。

第21页：增色效应和减色效应

增色效应和减色效应

由于化合物结构改变或其它原因，使吸收强度增加称增色效应；使吸收强度减弱称减色效应。强带和弱带(strong band & weak band)：摩尔吸光系数值大于104的吸收峰称为强带；小于102的吸收峰称为弱带。

第22页：R带由n→π*跃迁所产生的吸收带

1.R带由n→π*跃迁所产生的吸收带，是杂原子的不饱和基团，如C=O、-NO2、-N=N-等发色团的特征。特点：①处于长波长区(-300nm)，弱吸收。②溶剂极性增强，λmax短移。③附近有强吸收峰时，R带长移或被掩盖。吸收带(absorption band)及其与分子结构的关系

第23页：K带由共轭双键π→π*跃迁所产生的吸收带

2.K带由共轭双键π→π*跃迁所产生的吸收带。特点：①一般出现在较短波长区，210～250nm。②为强吸收，εmax>104③共轭双键增加，吸收峰长移，强度增加。

第24页：B带是芳香族

3.B带是芳香族(包括杂芳香族)化合物的特征吸收带。4.E带也是芳香族的特征吸收峰，由苯环中三个乙烯组成的环状共轭系统引起的π→π*跃迁所产生,分为E1带(180nm)和E2带(200nm)，均属强吸收。

第25页：电荷转移吸收带

5.电荷转移吸收带

是许多无机物和某些有机物混合而得的分子配合物，在外来辐射激发下强烈地吸收紫外可见光，从而获得可见或紫外吸收带。6.配位体场吸收带：是过渡金属水合离子和显色剂所形成的配合物，吸收适当波长的可见光(或紫外光)，从而获得的吸收带。

第26页：CH3CCH2CHCHCHCH2OR带

CH3CCH2CHCHCHCH2OR带K带

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第27页：影响吸收带的因素1.位阻影响顺式二苯乙烯

影响吸收带的因素1.位阻影响顺式二苯乙烯λmax＝280nm (10500)反式二苯乙烯λmax＝295.5nm (29000)

第28页：二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱

二苯乙烯顺反异构体的紫外吸收光谱

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第29页：跨环效应

2.跨环效应

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第30页：溶剂效应4. pH的影响

3.溶剂效应4. pH的影响

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第31页：Whatis

• Whatis UV-Visspectrophotometry?
• Basic principlesof UV-Vis?
• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?

第32页：分光光度法的基本定律——朗伯-比尔定律

分光光度法的基本定律——朗伯-比尔定律

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第33页：朗伯-比尔定律描述物质对单色光的吸收

朗伯-比尔定律描述物质对单色光的吸收(absorbance,A)与它的浓度(concentration)和厚度(thickness)间关系的定律。A

第34页：Lambert-Beer Law

Lambert-Beer Law

• Lambert’s Law(A vs. thickness)
• Beer’s Law(A vs. concentration)

第35页：A＝ECl浓度厚度吸光系数吸光度吸光系数

A＝ECl浓度厚度吸光系数吸光度吸光系数(absorptivity, E)吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度

第36页：摩尔吸光系数：是指在一定波长时

1.摩尔吸光系数

是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用ε表示。2.百分吸光系数：是指在一定波长时，溶液浓度为1％(W/V)，厚度为1cm的吸光度，用表示。

第37页：(单组分)样品的定量方法

(单组分)样品的定量方法(一)吸光系数法(二)标准曲线法(三)对照法

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第38页：(一)吸光系数法A= ECl

(一)吸光系数法A= ECl

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第39页：例维生素B12的水溶液在361nm处的值

例维生素B12的水溶液在361nm处的值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为0.414，则溶液浓度为：C = = = 0.002(g/100ml)AEl0.414207×1

第40页：λA200 240 280 320

λA200 240 280 320 360 400 440nm(二)标准曲线法λmax

第41页：CxAxA0Concentration要

CxAxA0Concentration要求1. r > 0.9992. n = 5-73.待测浓度尽量在标准曲线中间位置标准曲线(A=aC+b,r)

第42页：(三)对照法待测样品(Unknown

(三)对照法待测样品(Unknown sample)标准样品(Reference sample)

第43页：要求-标准溶液的浓度应尽量接近样品浓度=

要求-标准溶液的浓度应尽量接近样品浓度=A标A样C标C样C样=C标·A样A标

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第44页：(多组分)样品的定量方法

(多组分)样品的定量方法

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第45页：同单组分定量法Cb=

同单组分定量法Cb=(A-Aa)/Eb计算分光光度法

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第46页：计算分光光度法计算分光光度法是运用数学

计算分光光度法计算分光光度法是运用数学、统计学与计算机科学的方法，通过试验设计与数据的变换和解析，对物质进行定性定量的方法，属于化学计量学(Chemometrics)的范畴。

第47页：计算分光光度法数学变换法导数光谱法正交函

计算分光光度法数学变换法导数光谱法正交函数法褶合光谱法……数值计算法图解法双波长法系数倍率法三波长法……信号处理法-卡尔曼滤波法主成分分析法矩阵解法偏最小二乘法……

第48页：(一)数值计算法1、解线性方程组法

(一)数值计算法1、解线性方程组法

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第49页：2、双波长法a(待测)b(干扰)M

2、双波长法a(待测)b(干扰)M(混合)λ2λ1ΔA

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第50页：3、系数倍率法KAy2=Ay1则KA2=

3、系数倍率法KAy2=Ay1则KA2=K(Ax2+Ay2) A1=Ax1+Ay1ΔA=KA2⁻A1=K(Ax2+Ay2)⁻(Ax1+Ay1)=KAx2⁻Ax1＝(KEx2⁻Ex1)·Cx=K

Cx

第51页：4、偏最小二乘法

4、偏最小二乘法（PartialLeastSquaresMethod，PLS）偏最小二乘法充分考虑混合物校正矩阵Y和浓度矩阵C的相互关系，在分解Y的同时将C也进行正交分解，然后将T*对R*作线性回归，继而可进一步求出待测体系的浓度值。具有计算误差小、准确度高、运算速度快等优点。Y=USVt=U*S*Vt*+EY=T*Vt*+EYC=PGQt=P*G*Qt*+EC=R*Qt*+EC

第52页：5、卡尔曼滤波法

5、卡尔曼滤波法（Kalman Filtering Method，KF）卡尔曼滤波法是通讯与现代控制论中的一种有效方法。其基本思想为有效地利用已经得到的结果和最新的观察值来进行计算，递推算法是Kalman滤波方法的一个重要特点，目的是从获得的信号里尽可能地滤除干扰成分，分离出所需要的信号。

第53页：计算分光光度法数学变换法导数光谱法正交函

计算分光光度法数学变换法导数光谱法正交函数法褶合光谱法……数值计算法图解法双波长法系数倍率法三波长法……信号处理法-卡尔曼滤波法主成分分析法矩阵解法偏最小二乘法……

第54页：(二)数学变换法1

(二)数学变换法1、导数光谱法零阶一阶二阶三阶四阶

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第55页：导数光谱的定量方法p.峰谷法d.正切法z

导数光谱的定量方法p.峰谷法d.正切法z.峰-零法

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第56页：导数光谱法检定乙醇中痕量苯空白醇

导数光谱法检定乙醇中痕量苯空白醇(1)，醇中含苯0.0001%(2)与0.001%(3)的吸收光谱含苯0.0001%醇液的二阶(4)与四阶(5)导数光谱

第57页：2、褶合光谱法

2、褶合光谱法(Convolution Spectrometry)I通过数学变换，把被掩盖的信息提取出来、构造新的独立光谱体系；II以新的光谱体系为基础建立定性定量方法；III改造现有的分光光度计，向分光光度计智能化、自动化及多功能化发展。

第58页：Convolutiontrasforma

051015202530354000.10.20.30.40.50.60.7ConvolutiontrasformationOriginal spectrumConvolution spectra

第59页：褶合光谱与吸收光谱一样具有定性定量特征吸

褶合光谱与吸收光谱一样具有定性定量特征吸收光谱

A = ECl褶合光谱：Q= QijCl

第60页：(一)化学因素溶液中溶质可因浓度改变而有

(一)化学因素溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶剂间的作用等原因,而发生偏离Beer定律的现象。对此可控制溶液浓度、pH等条件而设法减免。偏离Beer定律的因素

第61页：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱

亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱(a)亚甲蓝阳离子溶液(6.36×10-6mol/L）(b)亚甲蓝阳离子溶液(1.27×10-4mol/L)(c)亚甲蓝阳离子溶液(5.97×10-4mol/L)

第62页：(二)光学因素

(二)光学因素

• 非单色光为了保证透过光的强度对检测器有明显的响应，狭缝就必须有一定的宽度，这就使分离出来的光，同时包含了所需波长的光和附近波长的光，即是具有一定波长范围的光。这一宽度称为谱带宽度。
• 是采用峰值测定的原因。

第63页：杂散光从分光器得到的单色光中

• 杂散光从分光器得到的单色光中，还有一些不在谱带宽度范围内的与所需波长相隔较远的光，称为杂散光(stray light)。
• 是不用末端吸收的原因。

第64页：散射光和反射光吸光质点对入射光有散射作用

• 散射光和反射光吸光质点对入射光有散射作用，入射光在吸收池内外界面之间通过时又有反射作用。散射光和反射光，都是入射光谱带宽度内的光，对透射光强度有直接影响。
• 是空白对比补偿的原因。

第65页：非平行光通过吸收池的光

• 非平行光通过吸收池的光，一般都不是真正的平行光，倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照射的平行光的光程长。
• 这种测量时实际厚度的变异也是同一物质用不同仪器测定吸光系数时，产生差异的主要原因之一。

第66页：(三)透光率测量误差

(三)透光率测量误差

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第67页：1、暗噪音

1、暗噪音(dark noise)暗噪音是光电检测器或热检测器与放大电路等各部件的不确定性引起的，与光讯号无关，可视为一个常量。其在A为0.2～0.7范围内，造成相对误差较小，为测量最适宜范围。(图10-11)

第68页：有一化合物在醇溶液中的λmax为240

有一化合物在醇溶液中的λmax为240nm,其ε为1.7×104，分子量为314.47。试问配制什么样浓度(g/100ml)测定含量最为合适。(3.70×10-4～1.29×10-3)

第69页：2、讯号噪音讯号噪音亦称讯号散粒噪音

2、讯号噪音讯号噪音亦称讯号散粒噪音。光敏元件受光照射时的电子迁移，每一单位时间中电子迁移数量是不相等的，而是在某一均值周围的随机数，形成测量光强时的不确定性。随机数变动的幅度随光照增强而增大，与光的波长及光敏元件的品质有关。

第70页：HowUV-Vis is

• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?
• HowUV-Vis is applied inqualitativeanalysis?
• UVSpectrophotometer

第71页：一、定性鉴别

一、定性鉴别

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第72页：（一）对比吸收光谱特征数据1.吸收峰2

（一）对比吸收光谱特征数据1.吸收峰2.谷3.肩峰4.末端吸收

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第73页：

第74页：(二)对比吸光度(吸光系数)的比值

(二)对比吸光度(吸光系数)的比值

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第75页：举例：UV-Vis法鉴别VB12注射液

举例

UV-Vis法鉴别VB12注射液

第76页：361nm550nm278nm【鉴别】取

361nm550nm278nm【鉴别】取含量测定项下的溶液、照紫外可见光光度法（附录Ⅳ A）测定，在351nm与550nm的波长处有最大吸收361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.15～3.45。

第77页：(三)对比吸收光谱的一致性将试样与已知标

(三)对比吸收光谱的一致性将试样与已知标准品配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性。两个化合物若是相同的，其吸收光谱应完全一致。也可利用文献所载的标准图谱进行核对。

第78页：定性原则：对比结果相同，可能是同一物质

定性原则

对比结果相同，可能是同一物质。对比结果不同，肯定不是同一物质。

第79页：丙酸倍氯米松-倍他米松紫外光谱图

丙酸倍氯米松-倍他米松紫外光谱图

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第80页：丙酸倍氯米松的1条吸收光谱倍他米松的1条

丙酸倍氯米松的1条吸收光谱倍他米松的1条吸收光谱比对比较褶合变换褶合变换135条褶合光谱135条褶合光谱

第81页：丙酸倍氯米松-倍他米松褶合光谱差谱图

丙酸倍氯米松-倍他米松褶合光谱差谱图(差谱比率83.31%)

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第82页：二、纯度检查

二、纯度检查

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第83页：(一)杂质检查例

(一)杂质检查例

乙醇和环己烷中苯的检查空白醇(1)，醇中含苯0.0001%(2)与0.001%(3)的吸收光谱含苯0.0001%醇液的二阶(4)与四阶(5)导数光谱

第84页：(二)杂质限量检查1.以某个波长的吸光度

(二)杂质限量检查1.以某个波长的吸光度值表示2.以峰、谷吸光度的比值表示例碘磷定λmax294nm处，杂质几乎没有吸收；但在λmin262nm处有一些吸收。(已知碘磷定A294/A262=3.39)A294/A262<3.39 ?肾上腺素(…)与肾上腺酮()的吸收光谱310nm

第85页：紫外可见分光光度法在结构分析中的应用

紫外可见分光光度法在结构分析中的应用（一）从吸收光谱中初步推断官能团（二）异构体的确定1.结构异构体2.顺反异构体（三）化合物骨架的确定

第86页：HowUV-Vis is

• HowUV-Vis is applied inquantitative analysis?(multi-component samples)
• HowUV-Vis is applied inqualitativeanalysis?
• UVSpectrophotometer

第87页：紫外－可见分光光度计在紫外-可见光区可任

紫外－可见分光光度计在紫外-可见光区可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器。

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第88页：光源单色器吸收池检测器讯号处理及显示器

光源单色器吸收池检测器讯号处理及显示器(一)主要部件

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第89页：光源要求

光源要求

能发射强度足够而且稳定的连续光谱，寿命长。1.钨灯或卤钨灯：适用波长范围是350～1000nm，必须使用稳压电源。2.氢灯或氘灯：适用波长范围是150～400nm，必须使用稳流电源。

第90页：单色器作用

单色器作用

将光源发出的复色光按波长顺序分离成单色光。组成：狭缝、准直镜、色散元件(棱镜、光栅)。

第91页：吸收池：也称比色杯

吸收池

• 也称比色杯。
• 玻璃吸收池只可以在可见光区使用，石英吸收池可在紫外-可见区使用。
• 盛放参比溶液与盛放样品溶液的吸收池需互相匹配。

第92页：检测器1、光电池2、光电管3

检测器1、光电池2、光电管3、光电倍增管4、光二极管阵列检测器(Diode Array Detector,DAD)II0

第93页：讯号处理及显示系统放大器表头显示荧屏显示

讯号处理及显示系统放大器表头显示荧屏显示数字显示

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第94页：Varian Cary 100

Varian Cary 100 UV-VisibleSpectrophotometer

第95页：(二)分光光度计的类型与光学性能

(二)分光光度计的类型与光学性能(1)单光束分光光度计(2)双光束分光光度计1、分光光度计的类型

第96页：单光束分光光度计

单光束分光光度计

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第97页：双光束分光光度计

双光束分光光度计

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第98页：

第99页：波长范围

• 波长范围
• 波长准确度
• 波长重现性
• 吸光度(透光率)测量范围
• 光度准确度
• 光度重复性
• 分辨率
• 杂散光2、分光光度计的光学性能

第100页：

第101页：3、分光光度计的校正

3、分光光度计的校正(1)波长校正(2)吸光度校正(3)吸收池校正

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第102页：紫外可见分光光度计的发展趋势

紫外可见分光光度计的发展趋势

• 小型化
• 智能化
• 在线化
• 网络化

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第103页：美国海洋光学的光纤光谱仪

美国海洋光学的光纤光谱仪(USB-4000型)

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第104页：什么是比色法？

什么是比色法？

• 对于能吸收可见光的有色溶液的测定方法。
• 许多不吸收可见光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能用比色法测定。
• 也称为可见分光光度法。

第105页：显色反应的条件1

显色反应的条件1、被测物质与所生成的有色物质之间，必须有确定的定量关系。2、反应产物必须有足够的稳定性。3、显色剂在测定波长处无明显吸收。4、反应产物的摩尔吸收系数足够大(103～105)，以保证灵敏度。5、显色反应须有较好的选择性，才能减免干扰因素。

第106页：影响因素1.试剂与溶剂2.酸碱度3.时间

影响因素1.试剂与溶剂2.酸碱度3.时间4.温度及其它

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第107页：为使反应能进行完全

为使反应能进行完全，常需有过量的显色试剂，但试剂的用量，可影响产物的组成。溶剂的性质可影响物质对光的吸收，使之呈现不同的颜色。1.试剂与溶剂

第108页：酸碱度许多有色物质的颜色

2.酸碱度许多有色物质的颜色，随溶液中的氢离子浓度而改变，同时显色反应的历程也多与溶液的酸碱度有关。有些反应甚至须用缓冲溶液来保持溶液的pH值。

第109页：时间由于反应速度不同

3.时间由于反应速度不同，完成反应所需时间常有较大差异。有色产物也会在放置过程中发生变化。对于一个显色反应中各个步骤所需时间和颜色能稳定地保持多久，常须通过实验确定。