页数：192页文件大小：1.89 MB来源： 发酵工程ppt课件
本课件系统讲解生产中常用菌种的分离、选育与保藏，从菌种来源与采样方法讲起，依次介绍细菌、放线菌与真菌的分离技术，诱变育种与营养缺陷型选育，基因育种与原生质体融合，最后给出冷冻、冻干与液氮等菌种保藏方法。
第四章 生产中常用菌种的分离、选育和保藏。
图示带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置，用于对微生物菌种进行显微观察与图像分析。
（一）采样 1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物、腐败物品、某些水域等。
从自然界筛选：按采样、增殖培养、培养分离、筛选与毒性试验的流程获得生产用菌种。
（四）筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。
四、自然界中细菌的分离：本节介绍细菌的采样与采集方法，以及分离培养基的组成原则。
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于 4℃ 下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。
放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、pH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。
七、生产选种：是在长年累月的生产实践中，在培养工艺条件没有任何可见变更情况下，突然发现某些批次生产水平提高较大，这就有可能是个别自然变异朝更好方向变的细胞，在这种条件下很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。
诱变方法分为物理诱变、化学诱变或生物诱变方法三大类。
（二）处理菌悬液的制备：这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心、洗涤、过滤。
（三）诱变处理：根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
（四）中间培养：由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程（生理延迟），需 3 代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。
方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来；若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
紫外线诱变一般采用 15W 紫外线杀菌灯，波长为 2537Å，灯与处理物的距离为 15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在 70～80% 为宜。
3．取 2～4ml 制备的菌液加到直径 9cm 培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W 紫外线下 30cm 处。在正式照射前，应先开紫外线 10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射 10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。
N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（NGN、MNNG 或 TG）对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的 DNA 复制系统，从而诱发了变异。MNNG 的诱变作用随 pH 的升高而增强。
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代谢途径、育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。
四、营养缺陷型生长谱的确定：验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。
生长谱测定的方法：将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与 MM 培养基（融化并凉至 50℃）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的 5～6 个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养。一个平皿测一个菌。
以不同组合的营养混合物与融化凉至 50℃ 的 MM 培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。在 5～6 个平皿上可测 20 株菌以上。
第六节 基因育种：基因重组育种是运用体外 DNA 各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另一个细胞的方法。
2.2 基因重组：本节介绍质粒的特点、质粒载体、转化以及重组 DNA 的操作。
质粒载体：质粒经改造后用作携带外源 DNA 进入宿主细胞进行扩增和表达的载体。
四、遗传转化：转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的 DNA 片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。
重组 DNA 中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、DNA 聚合酶、逆转录酶等。
限制性内切酶的剪切方式：本节介绍酶切后产生的粘性末端与平末端两种形式。
粘性末端：切开后的两段 DNA 各留下一个尾，这 2 个尾的核苷酸顺序完全一样，但方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。
DNA 分子的体外连接：DNA 片段的体外连接是重组 DNA 技术的关键，DNA 连接是由 DNA 连接酶催化完成的。
重组 DNA 导入宿主菌：体外连接的重组 DNA 分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组 DNA 分子导入受体可有不同的方法。
重组克隆的筛选与鉴定：基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。
重组 DNA 的鉴定：本节介绍重组 DNA 的遗传学鉴定方法。
第七节 杂交育种：本节介绍细菌杂交与酵母杂交育种技术。
（二）酵母杂交育种技术 1、酵母繁殖方式：酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。
单倍体细胞具 α 及 a 两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。
原文此处写作「α及ε2两种交配型」，据内容应为 α 与 a 两种交配型，已作修正。
三、原生质体融合育种的要点（一）标记菌种的选择：获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。
(二) 原生质体的制备：原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。
第九节 筛选新的代谢产物：本节介绍开发新代谢产物的途径、筛选程序、目标与方法。
二、筛选微生物新的代谢产物的程序：本节介绍突变型菌株的筛选，首先是产量性状突变株的筛选。
突变型菌株的筛选：一、产量性状突变株的筛选。
五、检测系统：筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非需要的代谢产物的检验方法，这样才能识别出人们需要的化合物。
菌种筛选方法：诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段。
特殊变异菌的筛选方法之营养缺陷型突变株的筛选：经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株。营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。
1) 恒化器法：常被用于微生物的驯化。在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快。为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术。随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离。
将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大。
3) 诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖。
第十节 工业微生物菌种保藏技术：在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
培养物的冻干过程：本节按操作步骤介绍冷冻干燥的具体过程。
不同菌种保藏方法比较：本节比较冷冻保藏、冻干保藏、传代保藏与矿物油浸没保藏等方法的适用对象与保藏期限。
2.4 基因工程菌的保藏：由载体质粒等携带的外源 DNA 片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。
对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征（如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标）应在保藏后加以检测和确定。
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