页数：81页文件大小：1.49 MB来源： 农业微生物学ppt课件
本课件先区分个体生长与群体生长，介绍稀释倒平板、划线、涂布等纯培养分离方法和七类生长量测定法，随后展开分批与连续培养下的延滞期、对数期、稳定期和衰亡期特征，最后分析温度、pH、氧及紫外、干燥等环境因子的影响。
第六章微生物的生长与环境因子Microbial Growth
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。
个体生长与群体生长个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。
可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长= 个体生长+ 个体繁殖通常把一个细胞分裂成两个细胞所需要的时间，称为代时。
一些细菌的代时：下表列出相关数据。
| 菌名 | 培养基 | 培养温度（℃） | 代时（min） |
|---|---|---|---|
| E. coli（大肠杆菌） | 肉汤 | 37 | 17 |
| E. coli | 牛奶 | 37 | 12.5 |
| Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） | 肉汤或牛奶 | 37 | 16～18 |
| E. aerogenes | 组合 | 37 | 29～44 |
| B. cereus（蜡状芽孢杆菌） | 肉汤 | 30 | 18 |
| B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） | 肉汤 | 55 | 18.3 |
| Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） | 牛奶 | 37 | 66～87 |
| Streptococcus lactis（乳酸链球菌） | 牛奶 | 37 | 26 |
| S. lactis | 乳糖肉汤 | 37 | 48 |
| Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） | 肉汤 | 37 | 23.5 |
| Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） | 葡萄糖 | 25 | 344～46 |
| Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌） | 组合 | 37 | 792～93 |
| Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） | 组合 | 27 | 1200 |
褐球固氮菌与结核分枝杆菌的代时区间在源文件中写作「344～46」「792～93」，区间方向存疑，已按原文录入，建议对照原课件核对。
第一节微生物纯培养分离及生长测定方法
一、获得纯培养的方法纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（Streak Plate）（3）平板涂布分离法（Spread Plate）（4）选择性培养分离法（5）单细胞（单孢子）分离法
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.这种方法适合于细胞较大的微生物.（1）液体稀释法
（2）平板划线分离法（Streak Plate）特点：快速、方便。
分区划线（适用于浓度较大的样品）连续划线（适用于浓度较小的样品）An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.
（3）平板涂布分离法（Spread Plate）简单易行，但易造成机械损伤Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.
（4）选择性培养分离法为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。
＊利用选择培养基进行直接分离＊富集培养
（5）单细胞（单孢子）分离法采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。
毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。
二、微生物生长量的测定方法（一）微生物细胞数目的检测法1。
总菌数的测定（计数器直接计数，染色涂片计数，比浊法）2。
活菌数的测定（平板计数法、液体稀释法、膜过滤法）
（二）微生物生长量的测定1。
直接法(干重法，体积法)2。
间接法（比浊法，碳、氮含量法，DNA测定法等）
1.血球计数板法
原理：将1mm2×0.02mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。
不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。
2.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。
方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×10×稀释倍数
3.平板菌落计数法
技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.
4。
薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。
将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。
5.干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。
该法适合菌浓度较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。
6.比浊法原理：是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。
因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。
特点：快速、简便；但易受干扰。
7.生理指标法
第二节微生物的生长曲线一、微生物培养：研究群体生长规律，首先应对微生物进行培养。
培养的方法有：分批培养和连续培养这两种方法既可用于纯种培养，也可用于混合
1 分批培养（batch culture）：分批培养（batch culture）：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。
不再补充和更换，最后一次性收获。
(P116)
2 连续培养（continuous culture）
原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。
单批培养恒浊法恒化法单批培养连续培养时间连续流入新鲜培养液lg细胞数（个/ml）连续培养（1）连续培养原理
恒化连续培养概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。
特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究及污水生物处理。
恒化器Chemostat 或bactogen
概念：调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。
主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。恒浊连续培养使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。
恒浊器与恒化器的比较：下表列出相关数据。
| 装置 | 控制对象 | 培养基 | 培养基流速 | 生长速率 | 产物 | 应用范围 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 恒浊器 | 菌体密度（内控制） | 无限制生长因子 | 不恒定 | 最高 | 大量菌体或与菌体形成相平行的产物 | 生产为主 |
| 恒化器 | 培养基流速（外控制） | 有限制生长因子 | 恒定 | 低于最高 | 不同生长速率的菌体 | 实验室为主 |
二、细菌的纯培养生长曲线
典型的生长曲线（Growth curve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同加速期减速期
其它名称：迟滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：P117
◆菌种：繁殖速度较快(世代时间短)的菌种的延迟期一般较短；◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆营养：培养基成分◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。
影响延迟期长短的因素：P116-117
认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在工业上需设法尽量缩短延迟期；P117采取的缩短lag phase 的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；
②.对数期（logarithmic phase）其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。
特点：生长速率最大，即代时最短菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种代谢产物营养物浓度﹡氧气
延长措施：定时定量加入营养物质，同时排出代谢产物，或使用连续培养。
应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。
③. 静止期（stationary phase）又称：稳定期或最高生长期特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的活细胞数目达到最高值。
应用意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：
④. 衰亡期（decline phase）特点：①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。
三.丝状微生物的群体生长（不讲）丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。
可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。
可分为三个阶段：1、生长停滞期2、迅速生长期3、衰退期
1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。
四、活性污泥中的微生物生长规律
五、微生物的生长曲线在废水处理中的应用P120
第二部分：环境因子微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它有害的一面。
一、温度对微生物生长的影响温度是影响微生物生长的最重要因素之一。温度对微生物的影响具体表现在：
最低生长温度: 指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度：指使微生物迅速生长的温度。最高生长温度：指微生物生长繁殖的最高温度界限。微生物
根据微生物的最适生长温度分类嗜冷微生物嗜温微生物嗜热微生物超嗜热或嗜高温微生物微生物类型最低温度oC最适温度oC最高温度oC嗜冷微生物-5-05-1020-30嗜温微生物5-1025-4045-50嗜热微生物3050-6070-80超嗜热或嗜高温微生物>5570-105110-113
嗜冷微生物嗜冷机制：
嗜热微生物嗜热机制
微生物不同生理过程的最适温度：下表列出相关数据。
| 菌名 | 生长温度（℃） | 发酵温度（℃） | 累积产物温度（℃） |
|---|---|---|---|
| Streptococcus thermophilus（嗜热链球菌） | 37 | 47 | 37 |
| S. lactis（乳酸链球菌） | 34 | 40 | 产细胞：25～30；产乳酸：30 |
| Streptomyces griseus（灰色链霉菌） | 37 | 28 | — |
| Corynebacterium pekinense（北京棒杆菌） | 32 | 33～35 | — |
| Clostridium acetobutylicum（丙酮丁醇梭菌） | 37 | 33 | — |
| Penicillium chrysogenum（产黄青霉） | 30 | 25 | 20 |
原文菌种名写作「Corenybacterium pekinense」，按标准属名 Corynebacterium 修正；「—」表示原表未给出该项温度。
高温与低温对微生物的影响1、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。用于灭菌。
灭菌（sterilization) 是指利用某种杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施.分干燥灭菌与湿热灭菌。消毒（disinfection) 是利用某种方法杀死或灭活物质或物质中所有病原微生物的一种措施。分为巴斯德消毒和煮沸消毒法。
消毒效果取决于消毒时的温度和消毒时间。防腐（antisepsis) 是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食品腐败或防止其它物质霉变。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病源微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施
二、pHpH值对微生物生长的影响机制◆影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。
◆改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在pH6.5以上产甘油、酸。
◆环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。
一些微生物的生长酸碱度
不同微生物的生长pH值范围：下表列出相关数据。
| 微生物 | 最低 pH | 最适 pH | 最高 pH |
|---|---|---|---|
| Thiobacillus thiooxidans（氧化硫硫杆菌） | 0.5 | 2.0～3.5 | 6.0 |
| Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） | 4.0～4.6 | 5.8～6.6 | 6.8 |
| Rhizobium japonicum（大豆根瘤菌） | 4.2 | 6.8～7.0 | 11.0 |
| Azotobacter chroococcum（圆褐固氮菌） | 4.5 | 7.4～7.6 | 9.0 |
| Nitrosomonas sp.（硝化单胞菌） | 7.0 | 7.8～8.6 | 9.4 |
| Acetobacter aceti（醋化醋杆菌） | 4.0～4.5 | 5.4～6.3 | 7.0～8.0 |
| Staphylococcus aureus（金黄葡球菌） | 4.2 | 7.0～7.5 | 9.3 |
| Chlorobium limicola（泥生绿菌） | 6.0 | 6.8 | 7.0 |
| Thermus aquaticus（水生栖热菌） | 6.0 | 7.5～7.8 | 9.5 |
| Aspergillus niger（黑曲霉） | 1.5 | 5.0～6.0 | 9.0 |
| 一般放线菌 | 5.0 | 7.0～8.0 | 10.0 |
| 一般酵母菌 | 3.0 | 5.0～6.0 | 8.0 |
原文菌种名写作「Thurmus aquaticus」，按标准属名 Thermus 修正。
同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。
举例：Aspergillus niger在pH2~2.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.5~6.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。
微生物生长最适pH合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.3~6.96.7~7.3红霉素链霉菌6.6~7.06.8~7.3产黄青霉6.5~7.26.2~6.8金霉素链霉菌6.1~6.65.9~6.3龟裂链霉菌6.0~6.65.8~6.1灰黄青霉6.4~7.06.2~6.5生长的最适pH值与发酵的最适pH值
三、氧化还原电位（Eh）
影响氧化还原电位的因素
四、溶解氧微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:专性好氧菌:好氧菌微好氧菌：兼性厌氧菌耐氧厌氧菌：厌氧菌(专性)厌氧菌：
专性好氧菌（strictaerobe）P128
水的活度和渗透压
其它不利环境因子的影响
紫外线定义：波长在100 —400nm的电磁辐射为紫外线。紫外线杀菌或诱变原理：
光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。
电离辐射χ、γ、β射线，波长短，能量高，有较强的杀伤力。作用原理：可引起水和其他物质的电离，产生游离基，使核酸、蛋白质或酶发生变化，造成细胞损伤或死亡。
特点：穿透力强，非专一性，作用于一切细胞成分，对所有生物均有杀伤作用。应用：用于杀菌或菌种诱变。
超声波超声波：每秒钟振动在1600以上的声波。
机理：引起膜破坏，细胞破裂，内涵物逸出。
应用：o破碎细胞，提取胞内物质（代谢产物、酶等）o杀菌,超声波杀菌效力大小与频率、强度、处理时间等多种因素有关。
微波微波：微波的范围在915—2450MHz/s之间。机理：微波产生热效应，使蛋白质、酶等物质变性，导致微生物死亡。
特点：加热均匀，热能利用率高、加热时间短。应用：食品消毒、灭菌。
干燥干燥抑制微生物生长或造成其死亡的原因：干燥能引起微生物细胞内蛋白质的变性和盐类等物质浓度提高，从而抑制生长或造成微生物死亡
重金属
抗生素：概念：抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。最小抑制浓度（Minimal Inhibitory Concentration,MIC）:表示抗生素的抗菌活性，单位是g/ml.MIC可以在液体试管或固体平板上测定，抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱～：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）；窄谱～：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素）作用机制：
化学药剂
常用化学药剂的类型与作用：下表列出相关数据。
| 类型 | 名称及使用方法 | 作用原理 | 应用范围 |
|---|---|---|---|
| 重金属盐类 | 0.05%—0.1%升汞、2%红汞、0.1%—1%硝酸银、0.1%—0.5%硫酸铜 | 蛋白质变性、酶失活；变性、沉淀蛋白 | 非金属器皿；皮肤、粘膜、伤口；皮肤、新生儿眼睛；防治植物病害 |
| 表面活性剂 | 0.05%—0.1%新洁尔灭、0.05%—0.1%杜灭芬 | 蛋白变性、破坏细胞膜 | 皮肤、粘膜、器械；皮肤、金属、棉织品、塑料 |
菌种的退化、复壮和保藏
一、防止菌种退化的方法
菌种的复壮措施
二、菌种的保藏菌种保藏的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死亡、不退化、不污染，以便于研究、交换和使用的目的。
常用的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC)
菌种保藏的原理
菌种保藏的方法定期移植法：斜面低温保藏法干燥法：砂土管保藏法、麸曲保藏法等隔绝空气法：液体石蜡保藏法蒸馏水悬浮法：藻类的保存综合法：以上方法的综合。
几种常用菌种保藏方法的比较：下表列出相关数据。
| 方法名称 | 主要措施 | 适宜菌种 | 保藏期 | 评价 |
|---|---|---|---|---|
| 冰箱保藏法（斜面） | 低温 | 各大类 | 3～6月 | 简便 |
| 冰箱保藏法（半固体） | 低温 | 细菌、酵母菌 | 6～12月 | 简便 |
| 石蜡油封藏法 | 低温、缺氧 | 各大类（产孢子微生物除外） | 1～2年 | 简便 |
| 沙土保藏法 | 干燥、无营养 | 产孢子微生物 | 1～10年 | 简便有效 |
| 冷冻干燥法 | 干燥、无氧、低温、有保护剂 | 各大类 | 5～15年以上 | 简便、有效 |
学习要点
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