第1页：重组DNA技术目录
- 1.1 重组 DNA 技术是基因工程的核心技术
- 1.2 获得需要的目的基因（外源基因）
- 1.3 构建重组质粒和基因克隆
- 1.4 转化受体细胞和转化子的筛选
- 1.5 转化子的分析——Southern 杂交
第2页：重组DNA技术是基因工程的核心技术
- 重组 DNA 技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
- 重组 DNA 技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
- 该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
- 所谓基因工程( geneticengineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。
- 11.1 重组 DNA 技术是基因工程的核心技术
第3页：重组 DNA 操作一般步骤
- 重组 DNA 操作一般步骤：（ 1）获得目的基因；
- （ 2）与克隆载体连接，形成新的重组 DNA 分子；
- （ 3）用重组 DNA 分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；
- （ 4）对转化子筛选和鉴定；
- （ 5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第4页：获得目的基因的常用方法
- 获得需要的目的基因常用的方法：（ 1）直接从生物体中提取总 DNA，构建基因文库( genelibrary)，从中调用目的基因；
- （ 2）以 m RNA 为模板，反转录合成互补的 DNA 片段；
- （ 3）利用聚合酶链式反应（ PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。
- 11.2 获得需要的目的基因（外源基因）
第5页：获得需要的目的基因（外源基因）
细胞内总 DNA 的提取分离与基因文库的构建细胞内总 DNA 的提取分离程序
第6页：获得需要的目的基因（外源基因）
紫外分光光度计测定 DNA 溶液的纯度和浓度。
第7页：便构成了该生物的基因文库
基因文库的构建将总 DNA 包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。
第8页：获得需要的目的基因（外源基因）
反转录人工合成互补 DNA 构建基因文库获取目的基因存在的问题——费时费事内含子序列反转录人工合成互补 DNA 方法的优势——获取的 DNA 片段往往是具有特定功能的目的基因
第9页：聚合酶链式反应
- 聚合酶链式反应（ PCR） PCR 技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。
- 加入 4 种物质：（ 1）作为模板的 DNA 序列；
- （ 2）与被分离的目的基因两条链各自 5’端序列相互补的 DNA 引物（ 20 个左右碱基的短 DNA 单链）；
- （ 3） Taq DNA 聚合酶；
- （ 4） d NTP（ d ATP, d TTP, d GTP 和 d CTP）。
第10页：PCR的变性退火延伸三步曲
聚合酶链式反应（ PCR）变性、退火、延伸三步曲变性：双链 DNA 解链成为单链 DNA 退火：部分引物与模板的单链 DNA 的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新 DNA 链
第11页：聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（ PCR）每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30 轮循环可获得——230（ 1.07×109)个基因片段
第12页：PCR技术的发明
PCR 技术的发明 PCR 的发明是 DNA 操作技术的革命美国 Mullis 教授开汽车时的联想逶迤崎岖的山路——DNA 双螺旋行驶的汽车——一小段 DNA 引物……1988 年发明了 PCR 技术 1993 年获得诺贝尔奖
第13页：构建重组质粒和基因克隆
- 基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。
- 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。
- 11.3 构建重组质粒和基因克隆限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀 Arber、 Smith 和 Nathans 因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了 1978 年的诺贝尔奖。
第14页：限制性内切酶与粘性末端
限制性内切酶已经发现和鉴定了 200 多种 Eco RI 特异识别 GAATTC 及其互补碱基组成的双链片段粘性末端 T4 连接酶
第15页：载体是运送目
- 载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、 l 噬菌体、 cosmid 质粒等。
- 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状 DNA 分子。
- 进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。
第16页：质粒载体的特点
- 1．该质粒比较小，可以插入一段较长的 DNA 片段。
- 2．进入宿主细菌细胞后， p UC18 在每个细胞中可复制形成大约 500 个拷贝。
- 3．在 p UC18 中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点细菌质粒 p UC18
第17页：lacZ基因与蓝白斑筛选
- p UC118 质粒的多克隆位点整合在 lac Z 基因中，该位点如果没有插入外源目的基因， lac Z 基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有 IPTG 和 X-gal， X-gal 便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。
- 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了 lac Z 基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆 4．利用 lac Z 基因的插入失活筛选重组质粒 5．p UC18 还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。
第18页：获得目的基因和质粒载体
- 以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1．获得目的基因和质粒载体；
- 2．形成重组质粒；
- 3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；
- 4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；
- 5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。
第19页：一般克隆基因的检查
一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力——不同迁移率分子量标准参照物酶切和电泳方法
第20页：转化受体细胞和转化子的筛选
32 P 标记的 DNA 分子探针杂交放射自显影法 DNA 杂交直接鉴定
第21页：基因克隆与目的基因扩增
- 基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。
- 这一过程就是遗传转化。
- 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。
- 对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。
- 通过 DNA 体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选
第22页：蓝细菌chlL基因缺失突变株
构建缺失 chl L 基因的蓝细菌突变株
第23页：遗传转化常用
遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法基因的直接转移（ 1）高压电脉冲电激穿孔（ 2）基因枪法（ 3）微注射法
第24页：转化子的分析——Southern杂交
纪念发明者 Edward Southern（ 1）提取总 DNA（ 2）酶解（ 3）电泳（ 4）转移到滤膜（ 5）变性解链（ 6） DNA 探针及杂交（ 7）洗脱（ 8）放射自显影（ 9）比较分析 11.5 转化子的分析——Southern 杂交
第25页：Southern杂交分析示例
Southern 杂交分析示例 A.DNA 体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D.Southern 杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中 1973 年，由美国斯坦福大学教授 Cohn 和美国加州大学教授 Boyer 带领各自的研究组几乎同时分别完成了 DNA 体外重组，一举打开了基因工程学大门。
第26页：本章摘要
- 重组 DNA 技术的一般操作步骤有：( 1)获得目的基因；
- ( 2)构建重组质粒；
- ( 3)转化受体细胞；
