页数：81页文件大小：1.99 MB来源： 功能基因组学ppt课件
本课件沿基因组与基因的概念界定、DNA测序方法、序列组装策略逐层展开，重点讲解链终止法与化学降解法测序原理、鸟枪法与指导测序的差异，并延伸至人类基因组计划与水稻基因组计划的测序路线与主要发现。
第一讲 基因组测序与序列组装：本讲从基因组与基因的概念出发，依次讲解DNA测序方法、序列组装策略，并延伸至人类基因组计划与水稻基因组计划。
基因组大小（Genome Size）：下表列出代表性物种的单倍体基因组大小。
| 物种 | 基因组大小（Mb） |
|---|---|
| 玉米 Zea mays | 8,000 |
| 人类 Homo sapiens | 3,000 |
| 水稻 Oryza sativa | 400 |
| 果蝇 Drosophila melanogaster | 165 |
| 拟南芥 Arabidopsis thaliana | 100 |
| 酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae | 12 |
| 大肠杆菌 E. coli | 4.6 |
图中阴影部分为一个门内C值的范围，可见从细菌、真菌到动物，C值整体呈上升趋势，但同一门内不同物种的C值差异极大，这正是C值悖理的直观体现。
DNA的复性遵循二级反应动力学，可表述为 dCt/dt = −KC²。其中Ct为反应达t时的单链DNA浓度，C0为单链DNA起始浓度，K为复性速度常数，代表顺序复杂性。
Cot(1/2) = 1/K (mol·Sec/L)。以Ct/C0对C0t作图，复性一半时所对应的C0t(1/2)值与基因组的复杂性成正比，据此可估算基因组中序列的复杂程度。
大多数真核生物蛋白质基因的编码顺序（Exon，外显子）都被或长或短的非编码顺序（Intron，内含子）隔开，这种不连续性是真核基因的典型特征。
一群具有一致或相似顺序的基因构成基因家族，有的还担负类似的生物学功能，可以相互补偿。下表为E2f转录因子家族的小鼠与人类直向同源基因对照。
| 小鼠 symbol | 人类 Ortholog |
|---|---|
| E2f1 | E2F1 |
| E2f2 | E2F2 |
| E2f3 | E2F3 |
| E2f4 | E2F4 |
| E2f5 | E2F5 |
| E2f6 | E2F6 |
同一段DNA能携带两种不同蛋白的信息，即为重叠基因，主要有以下几种情况。
基因B完全位于基因A内部，基因E完全位于基因D内部，但其读码结构互不相同。图中给出ATG起始密码子、AATGCC、ATAACG与TAA终止密码子的相对位置关系。
部分重叠如基因K与C；共用少数碱基对如基因D与J，二者在TAATG处衔接，D的终止密码子与J的起始密码子重叠使用同一段序列。
基本原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而读取待测DNA分子的顺序。
模板来源：克隆于质粒中的DNA经碱或热变性、M13克隆单链DNA、噬粒克隆DNA、PCR产生单链DNA。酶的要求：高酶活性、无5′→3′外切酶活性、无3′→5′外切酶活性。ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3′碳原子连接的是氢原子而非羟基。
基本原理：在选定的核苷酸碱基中引入化学基团，再用化合物处理，使DNA分子在被修饰的位置降解。
| 碱基 | 特异修饰方法 |
|---|---|
| G | pH 8.0，用硫酸二甲酯对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 |
| A+G | pH 2.0，哌啶甲酸使嘌呤环的N原子化，导致脱嘌呤，削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 |
| C+T | 肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易除去 |
| C | 1.5 mol/L NaCl |
图示为化学法测序的实际读序结果，经哌啶处理后DNA在修饰位点断裂，电泳条带自下而上依次读出核苷酸顺序。
基本原理与链终止法相同，只是用不同的荧光色彩标记ddNTP：ddATP标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，因而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。
基本原理：将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上，每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。待检测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号，然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序对比组装，拼接成完全的DNA顺序。
图示为利用基因芯片进行杂交测序的原理：芯片上固定的寡核苷酸探针阵列与待测DNA杂交，依据各位点信号的有无与强弱，按重叠关系将探针序列拼接成完整序列。
随机测序也称鸟枪法。序列组装原理：直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆，然后依次向两侧邻接的序列延伸。优点是不需预先了解任何基因组的情况。
鸟枪法测序的问题在于重复序列造成的错装：当基因组中存在CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP这类重复区段时，计算机拼装容易把不相邻的片段错误地连接在一起。
| 间隙类型 | 成因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| 顺序间隙 | 测序时遗漏的测序 | 通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库 |
| 物理间隙 | 载体或宿主菌选用不当而被丢失的顺序 | 利用其它宿主菌与载体重新构建文库 |
限制测序是指将一段染色体区段的DNA顺序进行组装。一些已绘制了遗传图与物理图的微生物基因组测序中也采用这一方法。如高等植物拟南芥基因组的测序完全依据克隆重叠群，先进行各个BAC克隆的随机测序，再进行序列组装；水稻基因组测序同样采用此路线。
建立在基因组图谱基础上的鸟枪法，即所谓指导鸟枪法或指导测序。人类基因组进入测序组装阶段即采用此方法，基本步骤如下。
先将染色体打成比较大的片段（几十至几百Kb），利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群（Contig），分别测序后拼装，这种策略称为基于克隆群（contig-based）的策略。
| 比较项目 | 鸟枪法策略 | 指导测序策略 |
|---|---|---|
| 背景信息 | 不需背景信息 | 构建克隆群（遗传、物理图谱） |
| 时间 | 时间短 | 需要几年的时间 |
| 设备要求 | 需要大型计算机 | 常规测序与组装 |
| 结果 | 得到的是草图（Draft） | 得到精细图谱 |
说明：原文该页为错位排版，本表依据上下文语义重新归位整理，核心对比项与原始表述保持一致。
人们对感兴趣的基因或与疾病相关的基因优先测序。如人类主要组织相容性复合区位于第6号染色体，与人类免疫系统有关，因而被优先测序。
人类基因组计划（Human genome project）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30 Mb的测序任务。
2000年6月26日，人类基因组的工作草图绘制完毕并向全世界公布。最终完成图要求测序所用的克隆能忠实地代表常染色体的基因组结构，序列错误率低于万分之一。
本部分介绍人类基因组测序的两条策略路线：Celera Genomics的全基因组鸟枪法策略与国际人类基因组测序协作组的分级鸟枪法策略。
人类遗传基因数量比原先估计的少很多。目前研究表明，人类基因组中约有3万至4万个蛋白编码基因，仅仅是果蝇基因数目的两倍，人有而鼠没有的基因只有300个。此结论是两大科研小组从DNA水平上得出的；而“人类有10万多个基因”则是从RNA水平得出的结论。
人类99.9%的基因密码是相同的，差异不到0.1%，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由单核苷酸多态性（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础，个体的多样性被认为是产生遗传疾病的原因。整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一。
随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就。人类基因研究的意义在于支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究，如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进化，细胞发育、生产、分化的分子机理，疾病发生的机理等。
在HGP完成之后，即全部人类基因被定序之后，还需要完成以下任务。
2002年我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多：人类基因大约有3-4万个，水稻有46 022-55 615个基因。水稻基因组是继人类基因组之后完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。由于水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。
本讲内容结束，谢谢！下一部分进入基因组序列诠释。
第二讲 基因组序列诠释：本讲围绕如何从已测定的基因组序列中寻找基因、获取全长cDNA、确定基因位置并研究基因功能展开。
1.1 根据开放读码框预测基因。起始密码子ATG的确定依据Kozak规则；Kozak规则是基于已知数据的统计结果，即第一个ATG侧翼序列的碱基组成具有偏好性。
若将第一个ATG中的碱基A、T、G分别标为1、2、3位，则Kozak规则可描述如下。
说明：源文件此页文本在“侧翼序列内不含碱”处中断，第二项内容不完整，已如实保留未作推测补全，建议对照原图补充。
信号肽分析软件 SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）把预测过程中证实含完整mRNA 5′端的Contig翻译为蛋白序列，然后用SignalP软件对其前50个氨基酸进行分析，判断是否存在信号肽。
终止密码子为 TAA、TAG、TGA。GC% = 50%时终止密码子每64 bp出现一次；GC% > 50%时终止密码子每100-200 bp出现一次。由于多数基因ORF均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是ORF不少于100个密码子。
3′端的确认主要根据 Poly(A)尾序列；若测试Contig不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。
高等真核生物多数外显子长度不少于100个密码子，有的不到50个密码子甚至更少，这是判断非编码序列与内含子边界时的参考依据之一。
编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ala）密码子多为GCA、GCC或GCT，而GCG很少使用。
外显子和内含子的边界有一些明显的特征：内含子的5′端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5′-AG↓GTTAAGT-3′；3′端又称受体位（acceptor site），多为 5′-PyPyPyPyPyPyCAG-3′（“Py”为嘧啶核苷酸，T或C）。
几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。另外个别生物的基因组特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。
可采用NCBI的ORF预测软件 ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）判断ORF的可能范围。
mRNA的5′端即转录起始位点区，可通过同源性比较来预测；最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库（The TRADAT）。
通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。
Northern杂交用于确定DNA片段是否为表达序列，注意事项如下。
基因表达产物丰度较低时，可用拟Northern杂交分析：根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。
动物园杂交依据的原理是：亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低。如果某一物种的DNA顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或多个基因。
图示为cDNA文库构建流程，包括mRNA的分离纯化、反转录合成第一链与第二链cDNA、末端修饰与接头连接等步骤。
图示为cDNA文库构建流程的后续环节，包括双链cDNA与载体的连接、体外包装与文库的扩增保存，为后续用目的基因片段筛选全长cDNA作准备。
5′RACE：根据已知片段设计基因特异引物，经反转录、加尾和PCR扩增，获得基因cDNA 5′端的未知序列，用于补全全长cDNA。
3′RACE：利用mRNA的Poly(A)尾设计锚定引物，结合基因特异引物进行PCR扩增，获得基因cDNA 3′端的未知序列。
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