第1页：基因重组与基因工程
基因重组与基因工程：本页为课件封面，标示本章主题与内容框架。
- 接合、转化、转导与转座等自然基因重组方式
- 限制性内切酶等工具酶与克隆载体的选择
- 重组DNA技术操作环节及其与医学的关系
第2页：基因重组与基因工程内容提要
基因重组与基因工程内容提要：本页为内容提要页，列出本节主要讲授条目。
- 基因研究的三步曲一、20世纪50年代以前：染色体遗传学阶段二、20世经50年代—70年代：基因的分子生物学阶段三、20世经70年代至今：DNA重组工程学的发展，基因研究走向反向生物学阶段
第3页：基因重组
- 基因重组
- (gene recombination)
- 是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
- 基因工程(geneticengineering）
- 是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA基本概念
第4页：基因重组与基因工程内容提要：DNA
基因重组与基因工程内容提要：DNA：本页为内容提要页，列出本节主要讲授条目。
- 因转移与重组一、接合作用(conjugation)二、转化(transformation)及转导(transduction)三、转座(transposition)四、基因重组第二节重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念二、重组DNA技术基本原理三、重组DNA技术与医学的关系
第5页：接合作用
接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的方式。一、接合作用(conjugation)
第6页：基因重组与基因工程要点说明
转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。二、转化(transformation)
第7页：基因重组与基因工程要点说明：DNA
转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用转导(transduction)
第8页：基因重组与基因工程要点说明：DNA
- 基因重组与基因工程要点说明：DNA
- *转染(transfection)
- 转染是转化的一种特殊形式。由transformation（转化）和infection（感染）两词构成。
- 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。
- 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。
- 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。
第9页：基因重组与基因工程要点说明：DNA
- 基因重组与基因工程要点说明：DNA
- 三、转座（transposition）
- DNA片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
- 转座是指由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。
第10页：插入序列
插入序列
- 典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500 bp
- 其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
第11页：转座子要点说明
转座子要点说明
- 转座子
- 转座子(transposons)
- 是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列；
- 含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如
第12页：免疫球蛋白
免疫球蛋白：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：•免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因…
建议对照原课件图片查看各反应步骤与物质转化关系。
第13页：
第14页：基因重组：DNA
- 基因重组：DNA
- 四、基因重组
- 位点特异性重组：
- 在整合酶的催化下，两段DNA序列的特异的位点处发生整合并共价连接，称为
- 同源重组：
- 发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组(homologousrecombination)
第15页：同源重组的机制
同源重组的机制
第16页：重组要点说明
第二节重组DNA技术
第17页：重组概念
- 重组概念
- 一、重组DNA技术相关概念
- DNA克隆
- 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
- 克隆化：获取同一拷贝的过程。
- DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组DNA ）：
- 应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质与载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。
第18页：基因工程
基因工程：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：基因工程•基因工程：重组DNA工艺学生物工程•基因工程•蛋白质工程•酶工程•细胞工程…
建议对照原课件图片查看各反应步骤与物质转化关系。
第19页：基因工程：DNA
基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，产生出人类所需要的基因产物或改造、创造新的生物类型。
第20页：工具酶功能
工具酶功能
- 工具酶工具酶功能
- 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA
- DNA连接酶催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基形成二酯键
- DNA聚合酶Ia.合成cDNA的第二条链b.缺口平移c.测序d.补平
- 反转录酶合成cDNA
- 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5‘羟基末端磷酸化
- 末端转移酶同聚物加尾
- 碱性磷酸酶切除末端磷酸基
第21页：限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
- 主要来源于原核生物，具有识别自身DNA或异源DNA的功能，通过切割破坏或限制异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。
- 识别特性：具有双链对称的回文结构
- 5’–G A A T T C -3’
- 3’–C T T A A G -5’
第22页：工具酶功能反应流程图
工具酶功能反应流程图：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：•Restriction-modification system1.restriction endonuclease2.methylase•Sticky endBlunt end…
建议对照原课件图片查看各反应步骤与物质转化关系。
第23页：
第24页：限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
- 命名：H in d III
- 属种株同一株具不同特异性酶
- 分类：I、II、III类，常用II类
- 异源同功酶：识别及切割位点相同
- 同尾酶：产生相同的粘性末端
- BamH I: G↓GATCC
- Sau3A I: ↓GATC
第25页：目的基因
目的基因
- cDNA：complementary DNA
- 经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。
- 基因组DNA：
- 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。
第26页：基因载体
基因载体
- 克隆载体（cloning vector)
- 携带目的基因、并实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
- 可充当克隆载体的DNA分子有：
- 质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA
第27页：基因载体要点说明
基因载体要点说明
- 质粒(plasmid)：
- 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的环状双链
- 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为
第28页：
第29页：
第30页：基因载体结构
质粒pUC19的分子结构
第31页：基因载体方式
基因载体方式
- 噬菌体：
- 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。
- 常用的为人工构建的λ噬菌体载体。
- 噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换
- 目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式
第32页：基因载体要点说明：DNA
基因载体要点说明：DNA
- 病毒：
- 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。
第33页：基因载体要点说明：质粒
基因载体要点说明：质粒
- 载体(vector)
- 供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具
- 载体具备条件
- 自主稳定复制
- 多克隆位点
- 遗传标记
- 插入容量大
- 分子量小，拷贝多
- 安全
- 载体的分类
- 按来源：质粒、噬菌体、病毒
- 按产物：克隆载体、表达载体
- 按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体
第34页：
第35页：重组DNA技术的基本原理
重组DNA技术的基本原理
- 目的基因的获取
- 克隆载体的选择与构建
- 外源基因与载体的连接
- 重组DNA导入受体菌
- 重组体的筛选
- 克隆基因的表达
第36页：
第37页：
第38页：DNA克隆的基本过程
DNA克隆的基本过程
- 分：分离目的基因
- 切：对目的基因和载体适当切割
- 接：目的基因与载体连接
- 转：重组DNA转入受体菌
- 筛：筛选出含有重组体的受菌体
第39页：分—载体和目的基因的分离
分—载体和目的基因的分离
第40页：
第41页：目的基因的来源
目的基因的来源
- 从染色体DNA中分离
- 人工合成
- 从mRNA合成cDNA
- 基因文库
第42页：切—限制性内切酶
二、切—限制性内切酶的应用酶辨认的序列和切口说明BamHⅠ …GGATCC …六核苷酸…CCTAGG …粘端切口EcoR Ⅰ …GAATTC …六核苷酸…CTTAAG …粘端切口Sma Ⅰ …CCCGGG …六核苷酸…GGGCCC …平端切口
第43页：接——把载体
接——把载体
第44页：
第45页：转—重组体的转化
转—重组体的转化
- 重组体导入大肠杆菌
- 氯化钙法
- 电击法
- 体外包装法
- 重组体导入哺乳动物细胞
- 磷酸钙共沉淀法
- 脂质体介导法
- 病毒感染法
- 显微注射法
第46页：转—重组体的转化要点说明
转—重组体的转化要点说明
- 五、筛—DNA重组体的筛选与鉴定
- 根据重组载体的表型进行筛选
- DNA限制酶切图谱分析
- 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定
第47页：基因工程技术策略分
基因工程技术策略分：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：基因工程技术策略分：基因载体目的基因质粒噬菌体病毒直接分离cDNA 人工合成基因文库切：限制性内切酶有缺口的载体目的基因接：连接酶粘端连接平端连接尾接法重组体转：转化转染体外包装带重组体的宿主筛：表型筛选电泳法核酸杂交…
建议对照原课件图片查看各反应步骤与物质转化关系。
