第1页：蛋白质的结构与功能（四）
蛋白质的结构与功能（四）：本页为课件封面，标示本章主题与内容框架。
- 蛋白质两性解离、等电点与胶体性质
- 变性与复性、沉淀与凝固的相互关系
- 盐析、电泳、层析、超速离心等分离纯化技术
第2页：蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质：本页为内容提要页，列出本节主要讲授条目。
- 一、蛋白质的理化性质二、蛋白质分离和纯化三、多肽链中氨基酸顺序分析——蛋白质一级结构的测定
- 两性解离和等电点及其分离纯化
第3页：蛋白质的理化性质要点说明
- 蛋白质的理化性质要点说明
- Pr是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2OH-H+OH-H+pH=pIpH<pIpH>pIpI定义：在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零此时溶液的pH值称为Pr的pI。
第4页：蛋白质的理化性质要点说明：蛋白质
Pr分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。原因：（二）蛋白质的胶体性质表面形成水化层表面同种电荷的斥力除去这两个因素,Pr就会发生沉淀。由于胶体溶液中的Pr不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。
第5页：蛋白质的变性
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，
第6页：变性后的蛋白质
变性后的蛋白质称变性蛋白,能使Pr变性的物质叫Pr变性剂。变性因素物理因素高温、高压紫外线、X射线、电离辐射和超声波等化学因素强酸、强碱有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、MW不变）。
第7页：变性蛋白质
变性蛋白质
- 的特点旋光性、光吸收改变等；①生物学活性丧失②理化性质改变③易被蛋白酶水解溶解度↓，沉降率↑，粘度↑，扩散速度↓，酶水解。变性与复性变性可逆变性：Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学活性还能恢复。不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性质难以恢复。举例：医疗；生物制品保存；生活等。
第8页：RNase的变性与复性
RNase的变性与复性
第9页：变性后的蛋白质：蛋白质
变性后的蛋白质：蛋白质：本页为小结页，归纳本部分核心结论与复习要点。
- 基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系变性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定变性变性Pr
第10页：蛋白质的变性反应流程图
蛋白质的变性反应流程图：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的沉淀带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（…
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第11页：大部分蛋白质均含有带共轭双键的
大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr和Trp。这两种AA在280nm附近有特征性吸收峰。在此波长范围，Pr的OD280
第12页：蛋白质的变性要点说明
反应试剂颜色反应基团有此反应的Pr及AA双缩脲反应NaOH,稀CuSO4紫或粉2个以上肽键所有蛋白质Millon反应Millon,硝酸，亚硝酸红色酚基Tyr黄色反应HNO3及NH3黄、橘黄苯基Phe,Tyr乙醛酸反应乙醛酸H2SO4紫红吲哚Trp
第13页：蛋白质分离和纯化研究Pr的结构
蛋白质分离和纯化研究Pr的结构
- 性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。
- Pr来源：微生物、动物或植物细胞；
- 随时测定Pr
第14页：分离方法沉淀
分离方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析……。电学法电泳法等电聚焦超速离心法纯度、Mw和pI测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如, 结晶法……
第15页：蛋白质分离和纯化研究定义
- 蛋白质分离和纯化研究定义
- 定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半饱和硫酸铵沉淀球Pr
第16页：电泳要点说明
- 电泳要点说明
- 电泳（electrophoresis)定义：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。Pr分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的Pr分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的泳动速度也不同，由此可彼此分离。（见实验理论）
第17页：电泳要点说明：蛋白质
电泳要点说明：蛋白质
- 电泳
- 带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反的方向泳动的现象叫电泳。利用这一原理，可以将蛋白质进行分离纯化。
第18页：板状电泳
板状电泳
第19页：等电聚胶电泳
等电聚胶电泳：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：等电聚胶电泳(isoelectric focusing gel IEF)…
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第20页：电泳反应流程图
电泳反应流程图：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：SDS-PAGE separates proteins by MW…
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第21页：电泳要点说明：蛋白质
电泳要点说明：蛋白质
- 试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂能与水以任意比例混合，有脱水作用。原理：①脱水作用；②↓水的介电常数和蛋白质溶解度。优点：分辨率优于盐析法，能使某一Pr在狭小有机溶剂浓度范围内沉淀。缺点：易使Pr变性应用：pI沉淀Pr。
第22页：层析要点说明
- 层析要点说明
- 层析（chromatography)定义：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。方法：离子交换层析；凝胶层析；吸附层析及亲和层析等。
第23页：离子交换层析法定义
- 离子交换层析法定义
- 利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的Pr进行分离的方法。分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等，阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素等原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过
第24页：带正电荷多蛋白紧密结合
带正电荷多蛋白紧密结合：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：•带正电荷多蛋白紧密结合•带负电荷多蛋白流过层析柱•阳离子交换树脂工作示意图…
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第25页：层析反应流程图
层析反应流程图：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：Cation-exchangecolumn…
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第26页：层析反应流程图
层析反应流程图：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：ColumnChromatography…
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第27页：凝胶过滤法
凝胶过滤法
第28页：亲和层析法琼脂糖凝胶连接臂
亲和层析法琼脂糖凝胶连接臂
第29页：层析反应流程图
层析反应流程图：本页为化学结构式与反应式页，源文件以分子式与反应符号形式提取：Affinitychromatography…
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第30页：透析法定义
- 透析法定义
- 透析法（Dialysis）定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。Pr溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。应用：
- 腹膜透析和人工肾；
- 反透析；
- 超滤利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜除去，Pr留在膜上而称之。操作:
第31页：透析工作图半透膜原理
透析工作图半透膜原理
第32页：超速离心
超速离心
- 利用物质密度的不同，Pr经超速离心后，分布于不同的液层而分离。
- 超速离心也可用来测定Pr的分子量，Pr的分子量与其沉降系数S成正比。
第33页：超速离心
超速离心
第34页：密度梯度离心步骤
密度梯度离心步骤：本页为反应流程示意页，源文件以分子式与反应符号形式提取：密度梯度离心步骤：A.形成密度梯度B. 加样C.离心D.收集样品…
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第35页：Pr含量测定法微量凯氏定氮法
Pr含量测定法微量凯氏定氮法
- 法：双缩脲法：样品量
- 2-
- 7mg/L改良Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合
第36页：Pr含量测定法微量凯氏定要点说明
Pr含量测定法微量凯氏定要点说明
- 考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下可与Pr上的正电荷结合，形成蓝色化物，在595nm具有特定吸收。紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml＝
- 45A280-
- 74A260
第37页：多肽链中氨基酸
多肽链中氨基酸
- 顺序分析——蛋白质一级结构的测定基本要求
- 样品要纯（>97%以上）；
- 测定Pr的分子量
- 知道Pr亚基数目；
- 测定Pr分子的AA组成；计算每种AA的个数。
第38页：多肽链中氨基酸方法
方法倒推法顺序测定法倒推法：组织Pr、DNAmRNAcDNA测定并识读cDNA序列分析AA组成，推知Pr一级结构逆转录酶
第39页：多肽链中氨基酸要点说明
蛋白质（纯）测定分子量，估计AA残基数（除120）氨基酸自动分析仪测定AA数量、种类和比例肽链拆开次级键：用8mol/L脲或6mol/L 盐酸胍二硫键：过甲酸；巯基乙醇；1，4－二硫代苏糖醇肽链末端分析N端：二硝基氟苯；丹磺酰氯法C端：肼解法；羧肽酶法肽链选择性裂解化学法：溴化氰裂解；羟胺法酶解法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶等肽段分离凝胶过滤离子交换层析氨基酸顺序分析：Edman法（异硫氰酸苯降解法）；酶解法多肽链中氨基酸序列分析的主要步骤
第40页：纯度、Mw和pI测定层析法
纯度、Mw和pI测定层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等免疫化学法：专一的沉淀线SDS PAGE电泳法：测定亚基数超速离心：成分均一其它：如, 结晶法……
第41页：名词解释氨基酸
名词解释氨基酸：本页为小结页，归纳本部分核心结论与复习要点。
- 残基亚基变构效应协同效应Pr的两性电离Pr的pI 盐析蛋白质变性超二级结构结构域分子伴侣复习思考题
第42页：为什么说
为什么说：本页为内容提要页，列出本节主要讲授条目。
- “蛋白质是生命的物质基础”？
- 简述蛋白质螺旋和折叠的结构特点。
- 什么是Pr的一、二、三和四级结构，分别指出维持它们结构的化学键。
- 举例说明Pr结构与功能的关系。
- 简述Pr变性、沉淀和凝固的定义及彼此之间的关系。
- Pr定量测定的方法主要有哪些？二、问答题
第43页：1 天然蛋白质
1 天然蛋白质中不存在的氨基酸是A蛋氨酸B胱氨酸C羟脯氨酸D同型半胱氨酸E精氨酸2下列哪种氨基酸在肽链中形成拐角A缬氨酸B酪氨酸C脯氨酸D苏氨酸E色氨酸三、选择题
第44页：有关血红蛋白
有关血红蛋白
- (Hb)和肌红蛋白(Mb)的叙述不正确的是A.都可以和氧结合B.Hb和Mb都含铁C.都是含辅基的结合蛋白D.都具有四级结构形式E.都属于色蛋白类
- 有一血清清蛋白(pI＝
- 85)的混合物，在哪种条件下电泳分离效果最好?A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 E.pH3.53 下列有关蛋白质β片层结构的叙述正确的是A.主链骨架呈锯齿状B.两个相邻的肽平面呈折纸状C.β片层结构是一种较伸展的肽链结构D.若干矩齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系E.以上都正确
第45页：名词解释氨基酸吸收
名词解释氨基酸吸收
- 蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是A.肽键B.半胱氨酸的-SH基C.苯丙氨酸的苯环D.色氨酸的吲哚环E.组氨酸的咪唑环
- 经凯氏定氮法测定，一血清标本的含氮量为10g/L ，那么，蛋白质的浓度是多少？A.
- 5g/L B.
- 5g/L C.
- 5g/L D.
- 5g/L E.
- 5g/L
第46页：下列蛋白质
下列蛋白质
- 通过凝胶过滤层析时最先被洗脱的是A.马肝过氧化氢酶(相对分子质量247500)B.肌红蛋白(相对分子质量16900)C.人血清清蛋白(相对分子质量68500)D.牛β乳球蛋白(相对分子质量35000)E.牛胰岛素(相对分子质量5733)
第47页：名词解释氨基酸要点说明
谢谢！
