页数：55页文件大小：2.55 MB来源： 功能基因组学ppt课件
本课件从开放读码框预测、同源查询与实验验证三条途径讲解如何寻找基因，介绍RACE获取全长cDNA的方法，进而展开转录物组与蛋白质组研究技术，并延伸到限制酶作图、克隆作图、FISH与STS作图等物理作图方法。
第二讲 基因组序列诠释（续）：本部分进入转录物组与蛋白质组，考察不同时期、不同组织与环境条件下基因的表达与蛋白质组成。
5.1 Northern杂交主要步骤如下。
SAGE（serial analysis of gene expression，基因表达系列分析），1995年由Velculescu及其同事创立。
SAGE步骤（1-5）：
SAGE步骤（6-10）：
图示为SAGE应用实例，通过对串联体中各标签出现频次的统计，比较不同状态下基因的表达丰度差异。
生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。
图示为生物芯片分类，按芯片上固定的探针分子与检测目标可分为基因芯片、蛋白质芯片等类别。
基因芯片技术是指通过微阵列（Microarray）技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器点样固定于芯片载体表面，实现对大量基因的同时检测。
说明：源文件此页文本在“通过高速机器”处中断，表述不完整，已如实保留未作推测补全，建议对照原图补充。
基因芯片的发展经历了 Southern & Northern Blot → Dot Blot → Macroarray → Microarray 的过程，检测通量与密度逐级提升。
图示为 Types of DNA Chips，按芯片基质与探针制备方式对DNA芯片进行分类。
图示为表达芯片的制备与检测流程，包括探针点样、待测样品荧光标记、杂交、洗脱与信号采集等步骤。
实例：PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库扩增产物，扩增产物点样于包被的玻片上制成DNA芯片；分别与热击T细胞cDNA和未处理的细胞cDNA杂交，激光共聚焦扫描后发现17个差异表达基因，11个被热诱导，6个被热抑制，发现其中3个为未发现的新基因。
遗传信息的流动与调控分为三个层次：DNA → mRNA 为转录水平调控（transcriptional control）；mRNA → PROTEIN 为翻译水平调控（translational control）；PROTEIN → 活性蛋白 为翻译后水平调控（post-translational control）。
Proteome来源于Proteins和genome两个词的组合，意思是 Proteins expressed by a genome，即基因组表达的蛋白质。
双向凝胶电泳流程：样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，去除非蛋白质杂质）→ 第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离）→ 第二向SDS-PAGE（以蛋白质分子量差异为基础）→ 蛋白质的检测（考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）→ 图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白）。
蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来进行胶内酶解，或转移到PVDF膜上进行膜上酶解，然后上样进行测序。目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，但其测定速度较快。
质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。
数据库的建立是蛋白质组研究最重要的一个方面。蛋白质数据库包括：
图示为与疾病相关蛋白质研究的基本策略，通过比较疾病组织与正常组织的蛋白质组差异，筛选差异蛋白并进行鉴定与功能验证。
物理作图（physical mapping）：应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置。物理图的距离依作图方法而异：辐射杂种作图的计算单位为厘镭（cR）；限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对（bp）。
限制性作图是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置，只能应用于较小的DNA分子。
图示为限制酶作图的基本原理：待检DNA分别经EcoR I、BamH I单酶切及双酶切后，依据片段长度（15 Kb、6 Kb、5 Kb、10 Kb、9 Kb及4 Kb等）的差异，推定各酶切位点的相对位置。
图示跨叠克隆群（Contig）与酶切位点的对应关系，相互重叠的克隆沿染色体依次排列，其上的酶切位点构成限制性物理图的基本框架。
稀有切点限制图绘制注意事项：识别顺序越长，产生的片段越大。选用识别位点较长的稀有切点限制酶，可获得适合大分子DNA分析的较大片段。
| 载体 | 名称 | 装载容量 |
|---|---|---|
| YAC | 酵母人工染色体 | 230-1700 Kb |
| BAC | 细菌人工染色体 | 300 Kb |
| PAC | P1人工染色体 | 300 Kb |
| Fosmids | 噬粒人工染色体 | 30 Kb |
本页介绍重叠群的组建方法，即通过比较各克隆所共有的特征判断其是否相互重叠。
指纹系指确定DNA样品所具有的DNA片段。指纹作图法通过比较不同克隆经限制酶消化后产生的片段指纹，判断克隆之间是否存在重叠，进而组建重叠群。
荧光原位杂交（FISH）：将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。
实例：用DNA纤维分析水稻第4号染色体，以DNA纤维为杂交载体进行FISH分析，可在更高的分辨率上确定探针之间的距离与排列顺序。
图示为STS作图原理：以STS位点为共同的坐标，用PCR检测各克隆中STS的有无，依据共有STS的数目判断克隆间的重叠关系并排定顺序。
寻找STS的方法之一是表达顺序标签（EST，expressed sequence tag）：从cDNA中找到的小段顺序。需注意基因家族成员之间的序列相似性可能带来交叉检出。
1990年Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为EST。
利用辐射杂种进行STS的物理图定位：选用不能合成胸苷激酶（TK）或次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT）的缺陷型细胞，从人体细胞中获得编码TK和HPRT的基因，在培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤筛选辐射杂种群；PCR检测STS标记，根据STS出现频率判断标记是否连锁及连锁程度。
克隆作图流程：提取基因组DNA，用流式细胞仪分离染色体并打断；构建全基因组DNA基因文库或构建指定单一染色体的基因文库；PCR检测STS分子标记；根据重叠STS标记绘制克隆连锁图。
图示为用STS构建Contig的结果：各克隆依据共有的STS位点被排成连续的重叠群，形成覆盖目标区段的物理图。
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