01 病原性真菌检验.ppt

第1页：第二节 病原性真菌检验

第二节　病原性真菌检验

本节内容分为三部分：第一部分 病原性真菌概述、第二部分 浅部真菌、第三部分 深部感染真菌。

第2页：真菌的概念与主要特征

真菌（Fungus）的主要特征：

• 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）
• 细胞壁含几丁质和（或）纤维素
• 无根、茎、叶，不含叶绿素
• 以腐生或寄生方式摄取养料
• 能进行有性生殖和（或）无性繁殖

第一部分　病原性真菌概述

第3页：致病真菌的分类与致病特点

对人类致病的真菌分为：

浅部真菌

侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对治疗有顽固性，但影响身体较小。

深部真菌

可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。

产毒真菌

寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。

第4页：真菌的形态结构

一、生物学性状　（一）形态结构

• 真菌细胞结构比细菌复杂。
• 细胞壁为几丁质（Chitin，多聚N-乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖、甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。
• 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。

第5页：单细胞真菌与多细胞真菌

真菌形态分单细胞和多细胞两类：

• 单细胞真菌：主要为酵母和类酵母菌（如隐球菌、念珠菌），呈圆形或椭圆形，以出芽方式繁殖。
• 多细胞真菌：由菌丝和孢子组成，菌丝分枝交织成团形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子，这类真菌一般称为霉菌（Mold）。
• 二相性真菌（dimorphic fungus）：由于营养、温度、氧气等生活环境的改变，孢子与菌丝两种形态可以互变，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。

第6页：真菌孢子与细菌芽胞的区别

真菌孢子和细菌芽胞的区别：

第7页：真菌的形态构成

真菌的形态构成：

• 菌丝：营养菌丝、气生菌丝→生殖菌丝。
• 孢子：
  • 有性孢子：由同一菌体或不同菌体上的两个细胞融合形成，绝大多数属于非致病性真菌所具有。
  • 无性孢子：
    • 分生孢子（生于分生孢子梗的顶端或侧面）：大分生孢子——小孢子菌属、表皮癣菌属；小分生孢子——毛癣菌属。
    • 叶状孢子（菌丝细胞直接形成）：芽生孢子——隐球菌、念珠菌；关节孢子；厚膜孢子——新型隐球菌。
    • 子囊孢子：菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊，内含很多孢子，如根霉菌。

原文将根霉菌「菌丝末端形成孢子囊、内含很多孢子」的描述列在「子囊孢子」项下，按孢子囊孢子理解更为贴切，此处依原文保留，建议核对原课件。

第8页：真菌菌丝形态

真菌菌丝形态：菌丝分枝交织成团形成菌丝体，可分化为伸入培养基吸收养料的营养菌丝与伸向空间的生殖菌丝。

第9页：真菌孢子形态

真菌孢子形态：真菌孢子形态、色泽多样，可着生于分生孢子梗顶端或侧面，亦可由菌丝细胞直接形成。

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第12页：真菌的培养特性

（二）培养特性

• 大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基（SDA）培养。
• 浅部病原性真菌的最适温度为22～28℃，生长缓慢，大多于1～4周出现典型菌落。
• 深部病原性真菌在37℃培养生长最好，生长较快，经3～4天即长出菌落。

第13页：真菌菌落类型

真菌菌落类型：

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第15页：真菌的变异性

（三）变异性

真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。

第16页：真菌的抵抗力

（四）抵抗力

• 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定耐受力；充分暴露于阳光、紫外线及干燥情况下，大多数真菌可被杀死。
• 对2.5%碘酒、10%福尔马林敏感，一般可用福尔马林熏蒸被真菌感染的房间。
• 对热敏感，一般60℃ 1小时可杀死真菌菌丝和孢子。

第17页：真菌的致病性

二、致病性与免疫性　（一）致病性

真菌引起的疾病大致包括：

• 1. 真菌性感染：主要是外源性感染。浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变；深部真菌侵犯皮下、内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。
• 2. 条件致病性真菌感染：主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。

第18页：过敏性真菌病与真菌毒素中毒症

真菌引起的疾病（续）：

• 3. 过敏性真菌病：由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘、变态反应性肺泡炎和癣菌疹等。
• 4. 真菌毒素中毒症：侵犯肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织，如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。

第19页：抗真菌免疫性

（二）免疫性

• 1. 非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力，包括皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。
• 2. 特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键；T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤，能局限和消灭真菌，以终止感染。

第20页：真菌感染的直接镜检

三、微生物学诊断　（一）直接检查

• 1. 不染色标本的直接镜检：直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在，即可初步判定为真菌感染。
• 检查步骤：1）标本制备；2）检查方法；3）封固液。

第21页：常用封固液

不染色标本直接镜检的常用封固液：

• ① KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
• ② 墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）。
• ③ 水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力较强，只限于不透明的标本。
• ④ 生理盐水：为观察真菌的出芽现象，可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

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第24页：染色标本检查

2. 染色标本检查：

• 1）革兰氏染色：各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。
• 2）乳酸酚棉蓝染色。
• 3）糖原染色：菌体均染成红色，用于标本直接涂片及组织病理切片染色。
• 4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。

第25页：粘蛋白卡红染色与荧光染色

染色标本检查（续）：

• 5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新型隐球菌荚膜的染色，隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。
• 6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

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第27页：真菌的培养检查

（二）培养检查

• 本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。
• 通常用沙保氏培养基（SDA），22～28℃培养。
• 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养。

第28页：真菌感染的免疫学试验

（三）免疫学试验

• 检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。
• 检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断：
  • 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原；
  • ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原；
  • 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原。

第29页：真菌感染的防治原则

四、防治原则

• 真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生。
• 碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效。
• 制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服，对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效。
• 近年报道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著。
• 二性霉素B可用于深部全身真菌感染。

第30页：浅部真菌与皮肤癣菌

第二部分　浅部真菌

浅部真菌主要为皮肤丝状菌（Dermatophytes），侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌（Ringworm），分为三属，共37个种。

第31页：皮肤癣菌三属特征

（一）生物学特征：皮肤癣菌三属的形态与侵犯部位差异见下表。

第32页：浅部真菌直接镜检

（二）检验方法

• 1. 直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在。本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法。

第33页：浅部真菌分离培养

• 2. 分离培养：取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70%乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃培养7～14天，根据菌落形态及颜色，并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。

第34页：毛癣菌属

毛癣菌属：菌落形态与镜检特征参见皮肤癣菌三属比较表，大分生孢子细长棒形、壁薄少见，小分生孢子梨形或棒形较多见，菌丝可见螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状与破梳状。

第35页：小孢子菌属

小孢子菌属：大分生孢子纺锤形、壁较厚、较多见，小分生孢子棒形或卵圆形、较少见，菌丝可见球拍状及破梳状。主要侵犯皮肤与毛发。

第36页：表皮癣菌属

表皮癣菌属：大分生孢子梨形、壁较薄、多见，无小分生孢子，菌丝为单纯菌丝。主要侵犯皮肤与指甲。

第37页：头癣的荧光检查

• 3. 荧光检查：本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。

第38页：深部感染真菌概述

第三部分　深部感染真菌

• 深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。
• 多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变。

第39页：深部感染真菌的两大类

深部感染真菌分两大类：

• 1. 致病性真菌：此类真菌在正常人体内部不存在，一旦侵入机体即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等，属外源性，我国少见。
• 2. 条件致病性真菌：是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力下降时才致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。

第40页：白色念珠菌概述

一、白色念珠菌

• 白色念珠菌（Canidia albicans）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道。
• 一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性真菌。

第41页：白色念珠菌生物学特性

（一）生物学特性

• 卵圆形，大小2μm×4μm，革兰氏染色阳性。
• 有假菌丝。

第42页：白色念珠菌培养特性

• 培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。
• 涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

第43页：白色念珠菌致病性与免疫性

（二）致病性和免疫性

白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起：

• 1. 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处。
• 2. 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。
• 3. 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。

机体可产生一定免疫力。

第44页：白色念珠菌检验方法

（三）检验方法及鉴定

• 1. 直接镜检：革兰氏染色镜检。
• 2. 培养特点：典型的类酵母型菌落。

第45页：芽管试验

3. 鉴定试验

• 1）芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，37℃水浴2～3h后，取出一接种环菌液涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。

第46页：TZC试验与糖发酵同化试验

• 2）TZC试验：将白色念珠菌接种于含0.005%氯化三苯四氮唑的沙保培养基中，经22～25℃、24～48h培养，白色念珠菌不变色或仅淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。
• 3）糖发酵和糖同化试验：根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。

原文写作「氯化三本四氮唑」，按通用名称规范为「氯化三苯四氮唑」。

第47页：动物实验与厚膜孢子形成试验

• 4）动物实验：本菌对兔有致病力。给兔耳静脉注射本菌，经4～5天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。
• 5）厚膜孢子形成试验：本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一。在玉米粉聚山梨酯-80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。

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第50页：念珠菌血清学诊断

• 4. 血清学诊断：用于诊断全身性念珠菌病，以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体。

第51页：新型隐球菌概述

二、新型隐球菌

• 新型隐球菌又名溶组织酵母菌，是土壤、鸽类、牛乳、水果等的腐生菌，也可存在于人口腔中。
• 可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染；对人类而言，它通常是条件致病菌。

第52页：新型隐球菌生物学特性

（一）生物学特性

• 较大球形，直径可达5～20μm。
• 有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，故称隐球菌。
• 用墨汁阴性显影法镜检，可见到透明荚膜包裹着菌细胞。
• 菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。

第53页：

第54页：新型隐球菌培养与鉴别

• 在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25℃及37℃皆可生长，而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。
• 酵母型菌落，呈白色。
• 本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。

第55页：

第56页：新型隐球菌致病性

（二）致病性

• 本菌大多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。
• 侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。
• 此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。

第57页：新型隐球菌微生物学检验

（三）微生物学检验

• 1. 直接镜检：常用墨汁涂片法。
• 2. 分离培养：在沙保培养基上，室温、37℃ 2～3天即可长出典型酵母型菌落，有荚膜者菌落粘稠。

第58页：新型隐球菌生化鉴定试验

• 3. 糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。
• 4. 酚氧化酶试验：在含L-多巴枸橼酸铁和咖啡酸培养基中，经2～5天培养，新型隐球菌出现棕黑色菌落。
• 5. 尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及酚红指示剂）中分解尿素形成氨和CO₂，使培养基pH值升高，酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。

原文写作「橘橼酸铁」，按通用名称规范为「枸橼酸铁」。

第59页：结束页

谢谢