页数：28页文件大小：1.13 MB来源： 生化分离工程ppt课件
本课件讲解沉淀法：从沉淀的定义、特点与七类方法入手，重点剖析盐析机理与 Cohn 方程式 logS=β−KsI，结合碳氧血红蛋白溶解度曲线说明盐种类、温度与 pH 的影响，并给出等电点沉淀、有机溶剂沉淀与热变性沉淀实例。
第4章 沉淀法
1. 沉淀法概述
2. 盐析沉淀
盐析机理示意图：高浓度盐离子与蛋白质竞争水分子，破坏其表面水化膜并中和电荷，蛋白质分子间相互聚集而析出。
盐析的机理
盐析沉淀基础：Cohn 方程式 logS=β−KsI，其中 S 为蛋白质溶解度，I 为离子强度。
图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系：在低离子强度区可能出现盐溶，随后溶解度随离子强度升高按 Cohn 方程呈对数线性下降。
不同蛋白质的溶解度曲线：不同蛋白质的 β 与 Ks 不同，曲线斜率与位置各异，这是分级盐析分离混合蛋白的基础。
蛋白质的盐析分布曲线：以盐饱和度为横坐标，描述目标蛋白在各饱和度区间的析出比例，可用于确定分级盐析的截取区间。
溶解度曲线（a）给出溶解度随盐浓度的变化，盐析分布曲线（b）给出析出量的分布，两者配合可确定分级盐析的收率与纯度最优点。
图7 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25 ℃）：(○) NaCl；(▼) KCl；(◘) MgSO4；(▲) (NH4)2SO4；(●) Na2SO4；(□) K2SO4；(■) 柠檬酸三钠。不同盐的盐析能力差异显著，硫酸铵因溶解度大、盐析能力强而最常用。
温度的影响：温度升高一般使蛋白质溶解度增大，盐析所需盐浓度提高；低温有利于析出但黏度上升，生产中常在低温下盐析并兼顾操作黏度。
pH 对 β 的影响：pH 偏离等电点时蛋白质净电荷增多、水合增强、β 增大；接近等电点时 β 最小，最易被盐析沉淀。
蛋白质起始浓度的影响：起始浓度越高，达到沉淀所需盐饱和度越低，但蛋白质间相互作用增强，共沉淀加剧、选择性下降。
二次盐析：先在一定饱和度下除去部分杂蛋白或收集目标组分，再调节盐浓度进行第二次沉淀，可在收率与纯度之间取得更好的平衡。
盐析操作：常用固体硫酸铵或饱和溶液加入，控制加盐速度与搅拌，陈化使沉淀颗粒长大后离心或过滤收集，随后进行脱盐处理。
3 等电点沉淀实例
4 有机溶剂沉淀原理：加入乙醇、丙酮等有机溶剂后溶液介电常数降低，蛋白质分子间静电引力增强、水化层被削弱，从而聚集沉淀。
有机溶剂沉淀实例：在低离子强度下加入预冷有机溶剂，控制温度与时间以防蛋白变性，沉淀后迅速离心分离并去除残留溶剂。
5 选择性热变性沉淀实例：酵母干粉中加入 0.066 mol/L 磷酸氢二钠溶液，37 ℃ 水浴保温 2 h，室温搅拌 3 h，离心收集上清液，升温至 55 ℃ 保温 20 min 后迅速冷却，离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳定性较高的醇脱氢酶。
7 凝聚和絮凝技术：凝聚剂压缩双电层使细小颗粒聚集，絮凝剂通过架桥形成大絮团，常与沉淀法配合以加快沉降与过滤。
第五章 沉淀法课后练习
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