页数：43页文件大小：1.08 MB来源： 生化分离工程ppt课件
本课件系统讲解层析分离技术：从 Tswett 提出色谱概念讲起，给出层析基本概念与分类体系，分别展开柱层析的介质、洗脱方法与装置，纸层析的滤纸选用与氨基酸分离实验，薄层层析的操作要点，最后对比吸附层析与凝胶、分配层析。
第8章 层析分离
层析法概述：色层分离法利用混合物中各组分在固定相与流动相间分配行为的差异实现分离，按机理可分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤与亲和层析等类型。
1.1 引言：色谱法是生化分离中分辨力最高的一类方法，既可用于分析鉴定，也可用于制备纯化；本章按概述、柱层析、纸层析、薄层层析与吸附层析的顺序展开。
色谱分离原理：样品随流动相通过固定相时，各组分因吸附或分配能力不同而迁移速率不同，经多次分配平衡后形成相互分离的谱带，实现混合物分离。
| 年代 | 发明者 | 发明的色谱方法或重要应用 |
|---|---|---|
| 1906 | Tswett | 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素，最先提出色谱概念 |
| 1931 | Kuhn, Lederer | 用氧化铝和碳酸钙分离 α-、β- 和 γ-胡萝卜素，使色谱法开始为人们所重视 |
| 1938 | Taylor Uray | 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素 |
| 1941 | Martin, Synge | 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱） |
| 1952 | Martin, James | 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法 |
| 1956 | Van Deemter | 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱 |
| 1957 | — | 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世 |
| 1958 | Golay | 发明毛细管柱气相色谱 |
| 1965 | Giddings | 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础 |
| 1975 | Small | 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法 |
| 1981 | Jorgenson | 创立了毛细管电泳法 |
| 类型 | 机理 | 优点 | 缺点 | 适用范围 |
|---|---|---|---|---|
| 吸附色谱 | 化学、物理吸附 | 操作简便 | 易受离子干扰 | 各种生物大分子的分离、脱色和去热源 |
| 凝胶过滤 | 分子筛的排阻效应 | 分辨力高，不会引起变性 | 各种凝胶介质昂贵，处理量有限制 | 分子量有明显差别的可溶性生物大分子 |
| 分配色谱 | 溶质在固定相和流动相中分配系数的差异 | 分辨力高，重复性较好，能分离微量物质 | 影响因子多，上样量太小 | 用于各种生物大分子的分析鉴定 |
| 亲和色谱 | 生物大分子与配体之间有特殊亲和力 | 分辨力很高 | 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大 | 各种生物大分子 |
| 聚焦色谱 | 等电点和离子交换作用 | 分辨力高 | 进口试剂昂贵 | 蛋白质和酶 |
柱层析法：将固定相装填于层析柱中，样品自柱顶加入后由流动相洗脱，各组分因保留能力不同而按先后次序流出，通过分部收集实现分离纯化，是制备规模最常用的层析形式。
浓度梯度制造器：由混合室与贮液室连通构成，随洗脱进行贮液室高浓度溶液不断补充混入，使流出液浓度按设定规律连续变化，用于实现梯度洗脱。
柱层析装置图：储液瓶经蠕动泵与层析柱相连，柱下接检测器与部分收集器，整套装置可按需要配置梯度混合器与记录仪。
纸层析法：以滤纸吸附的水为固定相、有机溶剂为流动相，样品点在滤纸一端，借毛细作用上行展开，各组分因分配系数不同而停留在滤纸的不同位置，用 Rf 值定性鉴别。
氨基酸分离结果：混合氨基酸经纸层析展开显色后形成多个分离斑点，斑点位置由各氨基酸的分配系数决定，可用于定性鉴别与纯度检查。
纸层析小实验动画演示：动态展示点样、密闭展开、斑点显色与 Rf 值测量的全过程，便于掌握操作要点。
| 型号 | 标重 (g/m²) | 厚度 (mm) | 吸水性 | 灰分 (%) | 性能 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 90 | 0.17 | 150—120 | 0.08 | 快速 |
| 2 | 90 | 0.16 | 120—91 | 0.08 | 中速 |
| 3 | 90 | 0.15 | 90—60 | 0.08 | 慢速 |
| 4 | 180 | 0.34 | 151—121 | 0.08 | 快速 |
| 5 | 180 | 0.32 | 120—91 | 0.08 | 中速 |
| 6 | 180 | 0.30 | 90—60 | 0.08 | 慢速 |
薄层层析法：将硅胶或氧化铝等吸附剂均匀涂布于玻璃板或铝箔上制成薄板，样品点样后在密闭槽中展开，具有分离速度快、灵敏度高、可同时分析多个样品的特点。
咖啡因的分离分析动画演示：以薄层层析分离茶叶提取液中的咖啡因，展开后测定斑点位置并计算 Rf 值，用于定性与含量比较。
芍药甙与丹皮酚薄层层析扫描图：两成分在薄层上获得良好分离，扫描峰的位置对应各自的 Rf 值，峰面积可用于定量分析。
吸附层析法：利用各组分在吸附剂表面吸附能力强弱的差异实现分离，吸附与解吸处于动态平衡，吸附剂种类、活度与洗脱溶剂极性是决定分离效果的关键因素。
| 类型 | 机理 | 优点 | 缺点 | 适用范围 |
|---|---|---|---|---|
| 吸附层析 | 化学、物理吸附 | 操作简便 | 易受离子干扰 | 各种生物大分子的分离、脱色和去热源 |
| 凝胶层析 | 分子筛的排阻效应 | 分辨力高，不会引起变性 | 各种凝胶介质昂贵，处理量有限制 | 分子量有明显差别的可溶性生物大分子 |
| 分配层析 | 溶质在固定相和流动相中分配系数的差异 | 分辨力高，重复性较好，能分离微量物质 | 影响因子多，上样量太小 | 用于各种生物大分子的分析鉴定 |
| 亲和层析 | 生物大分子与配体之间有特殊亲和力 | 分辨力很高 | 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大 | 各种生物大分子 |
| 聚焦层析 | 等电点和离子交换作用 | 分辨力高 | 进口试剂昂贵 | 蛋白质和酶 |
作业
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