第1页：第五节层析法又叫凝胶过滤、凝胶层析、凝
胶渗透层析、排阻渗透层析、分子筛过滤等
第2页：层析的原理“层析谱的本质是使一种液体
均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”——马丁（A. J. P. Martin）（英）
第3页：层析的分类
- 溶质分配机理的不同：
- 离子交换层析IEC离子交换剂
- 疏水性相互作用层析HIC疏水相吸附剂
- 层析聚焦离子交换剂、等电点
- 反相层析RPC非极性反相介质硅胶
- 羟基磷灰石层析HAP磷酸钙晶体
- 超临界流体层析SFC超临界流体流动相
- 灌注层析POROS聚苯乙烯-二乙烯苯，穿透孔和扩散孔，速度快。
第4页：凝胶层析的原理
将具有分子大小网状结构（孔隙）的凝胶粒子浸渍于某种溶液中时，溶液中的溶质分子凡是比网络孔隙小的都能自由进入凝胶粒子内，大的分子由于不能潜入网格便残留在溶液中，所以将分子大小不同的溶液（如蛋白质和硫酸铵）加入到分离柱中，只有小分子物质（硫酸铵）完全能进入凝胶粒子内，而大分子（蛋白质）则被排阻于粒子外，彼此互相筛分，加入洗液后，溶液在分离柱内向下移动，先流出的洗液中，全部含有大分子物质（蛋白质），后流出的洗液中含有小分子物质（硫酸铵），从而达到分离和提纯的目的。
第5页：色层分离法基本原理
色层分离法基本原理
第6页：色层分离法基本原理
色层分离法基本原理
第7页：分子筛层析示意图t1t0t1t2t0
t0t3t1t2t0分子量：> >
第8页：分配系数Kd
- Kd=(Ve-Vo)/Vi
- Vt= ∏ R2h/4
- Vt=Vo+(Vi+Vr)=Vo+Vs
- Ve---完全洗脱时的洗脱液体积
- Vo---层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积
- Vi---层析柱内凝胶颗粒内部微孔的总容积
- Vr---凝胶颗粒基质所占的容积
- Vi---凝胶内部微孔的总容积
- Vs---层析柱固定相的总体积
第9页：二、凝胶层析法常用的凝胶
- 1、天然凝胶
- 琼脂和琼脂糖凝胶（Sepharose）：能分离较大相对分子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高离子强度的洗脱液
- 2、人工合成凝胶
- （1）聚丙稀酰胺凝胶（Bio－Gel P）
- （2）交联葡聚糖凝胶（Sephedex）
第10页：三、凝胶层析技术
- 1、凝胶柱的制备（1）凝胶的预处理（2）凝胶的装填（3）层析床的检查（4）柱的平衡
- 2、样品和洗脱剂的准备洗脱剂：试剂是分析纯、水是纯水固体样品溶于洗脱剂中，无颗粒
第11页：（1）加样量的选择
- 3、加样
- （1）加样量的选择
- 脱盐、缓冲液交换等组分分离时加样体积为床体积的30％，如果要求较高的回收率，则为15％～20％。
- （2）加样方法
- 样品恰好全部渗入凝胶床，又不致凝胶床面干燥而发生裂缝
- 4、洗脱技术
- 洗脱流速高速涡流扩散严重，导致区带变宽
第12页：样品的检测、收集和处理
- 5、样品的检测、收集和处理
- 6、凝胶过滤介质的再生、清洗和储存
- 再生：用1.5～2个柱体积的洗脱剂完成洗脱过程
- 清洗：碱液清洗（0.1～0.5moL/L的NaOH）、乙醇、非离子型去污剂
- 保存：浸泡在抑菌剂的溶液中
- 注意事项：选择合适的凝胶、凝胶溶胀后再使用、注意防腐
第13页：柱层析分离法的有关装置
柱层析分离法的有关装置
第14页：Pharmacia Ä KTA层析系
统
第15页：Pharmacia Ä KTA层析系
统
第16页：四、层离设备1.分离柱2.恒压储液瓶3
不锈钢层析柱四、层离设备1.分离柱2.恒压储液瓶3.恒流泵4.洗脱液收集器5.恒温设备
第17页：五、影响凝胶层析的因素
- 1、凝胶的选择
- 2、凝胶粒度对分离效果的影响
- 3、洗脱液流速对分离效果的影响
- 4、离子强度和pH值
- 5、样品液体积
- 6、凝胶状长度、直径和分离效果的关系
- 7、Vo和Vi
第18页：六、防止微生物污染凝胶的方法
- 抑菌剂选用原则：
- 防腐剂不与凝胶发生作用
- 其浓度不会引起溶质的变化、沉淀和丧失生物活力
- 防腐剂不会使凝胶色泽变化
- 在紫外光部分尽可能没有吸收。
- 叠氮化钠、可乐酮、乙基汞代巯基水杨酸钠、苯基汞代盐、Chlorhexidin（IC2）
第19页：七、再生和干燥
- 再生：
- 葡聚糖凝胶：0.5mol/LNaOH和0.5mol/LHCl。
- 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶：盐溶液处理
- 一般加抑菌剂后湿态保存
- 干燥：按再生处理悬浮，除去碎颗粒，大量水洗涤去除盐等污染物，逐步提高酒精度的方法逐渐浓缩，60~80℃下干燥。
第20页：八、凝胶层析法在发酵中的应用
- 1、脱盐
- 2、凝胶层析法去除热源物质
- 3、凝胶浓缩高分子溶液
- 4、测定高分子物质的相对分子质量
- 5、分析
- 6、纯化青霉素
