第1页：
第2页：重点：柠檬酸生物合成途径柠檬酸生物合
成的代谢调节机制难点：柠檬酸生物合成的代谢调节机制
第3页：一、柠檬酸简介
- 柠檬酸，枸橼酸（jǔ yuánsuān），citric acid
- 学名：2-羟基-1,2,3-己三酸2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylic acid
- 是生物体主要代谢产物之一。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
- 以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高第一节概述
第4页：食品工业
- 酸味剂、增溶剂、防腐剂，除腥脱臭剂；
- 医药工业：柠檬酸根离子+钙离子→难于解离的可溶性络合物，因而降低了血中钙离子浓度，使血液凝固受阻。在输血或化验室血样-体外抗凝药
- 化学工业：鳌合剂，迅速沉淀金属离子
- 美容品、化妆品：加快角质更新，有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解
- 饲料业：可以提早断奶，提高饲料利用率5%～10%，增加母猪产仔量
- 环保：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液用于烟气脱硫
- 日常生活中，除铁锈、霉斑二、柠檬酸及其盐的应用概况
第5页：饮料导致缺钙的原因？？？
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第6页：桃子为什么那么红？鉴别？
桃子为什么那么红？鉴别？
第7页：从柑橘提取固态发酵
- （薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品）液态浅盘发酵50（黑曲霉，泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉）深层发酵52（黑曲霉/薯干粉，1968）
- 石油（石蜡油）：解脂假丝酵母--50%提高至80%
- 固定化细胞循环生物反应器发酵技术每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜，2.2～2.3t薯干粉或1.2～1.3t蔗糖。
第8页：三、我国柠檬酸生产现状生产状况
- 60年代开始，年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有6家。主要有安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为12.0万吨/年）、江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司（生产能力为4.0万吨/年）、安徽华源生物药业有限公司（生产能力为3.5万吨/年）等。
- 存在问题：出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到60%，行业经济效益呈滑坡态势。
第9页：
第10页：第二节柠檬酸合成途径与代谢调控1940
年，Krebs: TCA；1953年，Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶；1954年，Shu提出葡萄糖80%经EMP途径代谢；1954-1955年，Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环。一、柠檬酸合成途径的发现
第11页：二、柠檬酸发酵机理
关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)→丙酮酸丙酮酸羧化→C4（草酰乙酸）→缩合→柠檬酸丙酮酸脱羧→C2（乙酰CoA）
第12页：（一）、柠檬酸的溢出代谢多种微生物均能因
受刺激而过量合成柠檬酸。黑曲霉特定环境条件下能累积柠檬酸，∵代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是其特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以下三个方面
第13页：①高水平的柠檬酸合成能力②较低的降解
柠檬酸的能力③柠檬酸的分泌
第14页：①高水平的柠檬酸合成能力3个因素构成
一：高浓度草酰乙酸（OAA）时，对AcCoA具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在二：是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在三：是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。CSPCPFK
第15页：②较低的降解柠檬酸的能力两个因素构成一
是低水平的α-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；二：在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸）更明显。KDAEAEID
第16页：在黑曲霉柠檬酸产生菌中
TCA循环的一个显著特点是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
第17页：③柠檬酸的分泌在柠檬酸过量合成阶段
培养基的pH值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。
第18页：黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出GG-6-P
磷酸果糖激酶柠檬酸,NH4I+A1.6－二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸乙酰CoA柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸丙酮酸羧化酶(柠檬酸合成酶)α-酮戊二酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶
第19页：（二）、TCA循环在CTA积累中的调节
- 1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；
- 2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;
- 3）TCA循环的阻断或减弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。
第20页：（三）、回补途径☆TCA循环功能
产能，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断☆回补方式：①CO2固定作用②转氨基作用③乙醛酸循环
第21页：★通过某些化合物的CO2固定作用使三
羧酸循环的中间产物得到回补：丙酮酸羧化酶CO2+丙酮酸+ATP+H2OMg++草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶CO2+PEP+ H2O草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶CO2+丙酮酸+NADPH+H+苹果酸+ NADP+为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。①CO2固定作用补充TCA环的中间产物
第22页：
第23页：②转氨基作用
- 定义：α-氨基酸的氨基通过酶的催化，转移到α-酮酸的酮基上，生成相应的氨基酸；原来的α-氨基酸则转变成相应的α-酮酸。R1
- CHNH2+
- COOHR2
- C=O
- COOHR1
- C=O +
- COOHR2
- CHNH2
- COOH转氨酶
第24页：（1）可逆反应
转氨基作用几点说明：（1）可逆反应（2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的转氨酶：丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（GPT）天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶(GOT)ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断AST用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）
第25页：CH3
- H-C-NH2+
- COOHCOOH
- （CH2）2
- C=O
- COOH丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT活性显著增高。ALTCH3
- C=O+
- COOHCOOH
- （CH2）2
- H-C-NH2
- COOH
第26页：COOH
- CH2
- +H-C-NH2
- COOHCOOH
- （CH2）2
- C=O
- COOHAST天冬氨酸α-酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.COOH
- CH2
- +C=O
- COOHCOOH
- （CH2）2
- H-C-NH2
- COOH
第27页：能够利用乙酸的微生物
具有乙酰CoA合成酶（ACS），它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶（ICL）和苹果酸合成酶（MS）的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+乙酸苹果酸琥珀酸+乙酸→ → →异柠檬酸净反应：2乙酸苹果酸③乙醛酸循环3乙酸→1柠檬酸
第28页：③乙醛酸循环ACSICL草酰乙酸柠檬
- 酸琥珀酸异柠檬酸苹果酸延胡索酸乙酰CoA乙酸乙醛酸乙酰CoA烃类β氧化CoAMS
- 生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸
- 酵母N源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度AMP抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累。此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸= 90：7：3。细胞质中积累大量异柠檬酸。
第29页：（四）总结柠檬酸发酵机理
- 大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使EMP途径的代谢得到加强。
- 葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。
第30页：葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A
- (CH3CO-CoA)CO2固定反应+草酰乙酸顺乌头酸酶柠檬酸异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶琥珀酸α—KGA（柠檬酸合成酶）柠檬酸发酵机理
- 按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后面的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。
第31页：（五）、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制
- ——追求柠檬酸的高产率
- 柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？
第32页：磷酸果糖激酶
- 1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节
- 从葡萄糖→→柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，……
- 菌体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸在正常情况下，柠檬酸、ATP对PFK有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。
第33页：磷酸果糖激酶
- 1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节
- 研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn2+缺乏的培养基中，NH4+浓度会异常升高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn2+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。
第34页：Mn+缺乏如何
- 会使NH4+浓度升高呢？
- Mn+缺乏时，NH4+↑，同时微生物体内积累几种氨基酸（Glu、Arg、Gln等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，∴NH4+的消耗↓，NH4+浓度就会↑
- 微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系图氨基酸→蛋白质→氨基酸氨基化合成氨基酸
第35页：Mn2+缺乏HMP、TCA酶水平低蛋
白质再合成受损PFK抑制解除NH4+积累柠檬酸积累添加锰离子，抑制需延迟几小时
第36页：顺乌头酸酶活性的控制
- 2.顺乌头酸酶活性的控制
- 该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。
- 通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需控制。该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度又要求不能够低于0.1mg/L。随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。
第37页：顺乌头酸酶的活性
从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以提高柠檬酸产率。
第38页：菌体要大量合成柠檬酸
从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响
第39页：如果NADH
（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。氧化，不磷酸化
第40页：柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成
- 柠檬酸，也就是说，NADH既被氧化了，又没有产生ATP。
- 假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。
第41页：解偶联剂
- （uncoupler）?
- 使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+梯度，因而无ATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：
- 质子载体：2，4-二硝基酚(DNP，图)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。
- 质子通道：增温素（thermogenin）。
- 其它离子载体：如缬氨霉素。
- 某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。
第42页：侧系呼吸链
- 强烈需氧，
- 缺氧会导致此侧系呼吸链的不可逆失活
- 标准呼吸链：使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败（另外，氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体）
第43页：CO2固定反应
- 通过CO2固定反应提供C4二羧酸
- （1）磷酸烯醇式丙酮酸+ CO2==草酰乙酸（C4）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
- （2）丙酮酸+ CO2===草酰乙酸（C4）酶：丙酮酸羧化酶激活剂：钾离子
- 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。
第44页：柠檬酸发酵中
三个控制点C6H12O6控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制（1）点：EMP畅通无阻控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸乙酰辅酶A + C4二羧酸柠檬酸（3）点：柠檬酸后述的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+的浓度柠檬酸发酵中，三个控制点
第45页：第一个调节点是磷酸果糖激酶
（PFK）Δ柠檬酸和ATP对该酶有抑制生产菌需要解除该抑制作用AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量ΔMn2+的影响：Mn2+缺乏菌体的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解NH4+水平升高减少柠檬酸对该酶的抑制
第46页：第二个调节点
CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应第三个调节点：TCA环上调节柠檬酸合成酶：许多细胞中该酶是TCA的调节酶，但在黑曲霉中此酶无调节作用顺乌头酸水合酶：理论上此酶失活TCA环阻断积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+故在发酵液中添加黄血盐络合Fe2+阻断TCA环，积累柠檬酸
第47页：柠檬酸的积累机制总结
- 1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；
- 2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。
第48页：柠檬酸的积累机制总结
- 3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡--柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸＝90∶3∶7；
- 4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；
- 5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；
- 6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。
第49页：提高磷酸果糖激酶的活性
柠檬酸积累的酶条件：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高柠檬酸合成酶的活性4、抑制顺乌头酸酶的活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性7、提高异柠檬酸裂解酶的活性
第50页：柠檬酸发酵
- 需要下述环境条件
- (1)磷酸盐浓度低；
- (2)氮源用NH4+盐；
- (3)pH值低（<3.0）；
- (4)溶氧量高；
- (5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。
第51页：三、柠檬酸发酵的产率
1、无CO2固定反应的产率合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理论产率为：192 /( 180×1.5) =71.1%
第52页：通过CO2固定反应提供C4二羧酸
2、通过CO2固定反应提供C4二羧酸
第53页：四、柠檬酸产生菌育种的传统方法
1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯+ 2 %的琼脂+ 0.5% CaCO3诱变后，涂布，透明圈大的则好2.显色圈大小平板：麦汁培养基+ pH值指示剂诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。
第54页：不分解柠檬酸的菌株不
3.不分解柠檬酸的菌株不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸。方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株。4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
第55页：在搅得起沫儿的鸡蛋清儿里拌上糖粉、柠
檬酸，然后用蘸过凉水的汤勺儿把这蛋白浆一团一团地抛到慢慢煮沸的牛奶里，不让它们粘在一起。这些加了柠檬酸的蛋白浆即和牛奶发生作用，吸入牛奶，从而变成一颗颗‘小雪球’。把小雪球煮三分钟，然后用漏勺把它们轻轻捞到筛子上，等小雪球干后，再把它们一个一个分摊在加有调味汁的盘子上，不要让它们连在一块儿。“调味汁的做法：把生鸡蛋黄和砂糖仔细拌匀，加一汤勺儿面粉，再倒人煮开的牛奶，在火上一边煮一边搅拌，直到调味汁稍稍变稠为止。然后再加香兰素，搅拌，搁着使其冷却。“做一份小雪球需用两个鸡蛋清儿，3O公分糖粉，l公分柠檬酸，200公分牛奶。调味汁需用100公分牛奶，100公分砂糖，一个鸡蛋黄，香兰素按口味加。”烤小雪球-------铁凝《大浴女》
第56页：思考题1.柠檬酸发酵过程中有哪几个控
制要点，如何控制？2.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。3.简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。
