15 第12章-2 发酵醪的预处理.pptx

第1页：2发酵醪的预处理Pretreatm

12.2发酵醪的预处理Pretreatment

第2页：含水量高

• 发酵液的一般特征
• 1、含水量高，一般可达90％～99%
• 2、发酵产物含量较低（10%以上；氨基酸；抗生素）
• 3、悬浮固体物颗粒小，密度与液体相差不大
• 4、液体黏度大，大多为非牛顿型流体
• 5、成分复杂：1）培养基残留；2）发酵副产物；3）有机杂质
• 6、固体粒子可压缩性大
• 7、产物性质不稳定

第3页：发酵液预处理

• 的目的预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：
• ⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。
• ⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。
• ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）；

第4页：发酵液预处理

• 的要求
• 1）菌体的分离
• 2）固体悬浮物的去除
• 3）蛋白质的去除
• 4）重金属离子的去除
• 5）有机杂质的去除（色素、热原质、毒性物质）
• 6）改变发酵液的性质(pH)
• 7）调节适宜的pH和温度

第5页：菌体分离

• （cell separation）
• 菌体、固形物杂质、悬浮固体物质与液体分开
• 又叫固液分离
• 工业常用的菌体分离方法：
• 离心Centrifugation---细菌，酵母
• 过滤Filtration---丝状菌，细胞个体较大的菌
• 膜分离Membrane separation
• 双水相萃取ATPS
• 扩张床吸附EBA

第6页：一、影响发酵液固液分离的因素

1.发酵液中悬浮离子的大小

第7页：一、影响发酵液固液分离的因素2.发酵液

• 的黏度viscosity：固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：
• 菌体的种类和浓度（重要因素），通常丝状菌、动物或植物细胞悬浮液粘度较大，浓度增大，粘度也提高。
• 培养液中蛋白质、核酸大量存在：通常细胞破碎或细胞自溶后粘度增大。因此细胞破碎的程度应控制，发酵放罐时间要适宜。
• 培养基成分：如用黄豆粉、花生粉作氮源，淀粉作碳源，粘度都会升高。
• 此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大。
• 发酵过程的不正常处理，如大量过剩的培养基和消沫油加入，都会使粘度增大。

第8页：菌体分离

• 的目的包括两方面：
• 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，
• 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。

第9页：二离心分离

• 对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。
• 但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。
• 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。
• 动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。

第10页：按离心机的作用方式

• 管式（工业用，沉降式离心机）
• 蝶式（工业用，沉降式离心机）
• 斜角式（实验室）
• 平抛式（实验室)
• 螺旋式（工业用，连续处理量大）
• 多室（工业用）
• 离心过滤机（工业用） 离心机的种类与用途工业用离心机：
• 沉降式离心机：管式、碟式
• 离心过滤机：分批式、自动间歇式、连续式

第11页：1）管式离心机

• （tubular-bowl centrifuge）
• 管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，
• 转鼓内装有纵向平板，
• 其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口。

第12页：管式离心机

• 待处理的物料在一定压力（3×104Pa左右）下由进料管经底部空心轴进入鼓内，
• 靠挡板分布于鼓的四周，并使料液迅速达到与转鼓相同的角速度。
• 转鼓带动物料高速旋转，在离心力下，悬浮液沿转鼓内壁向上流动的，料液在离心力场的作用下因其密度差的存在而分离。
• 澄清后的液相流动到转鼓上部的排液口排出。
• 比重大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成
• 沉渣层，达到一定数量后，停机人工清除。

第13页：管式离心机

• 特点：
• 结构简单，
• 可提供较大离心力，转速高，分离因数高达15000-65000。
• 管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离
• 间歇操作，须定时拆卸、清洗
• 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。
• 分离因数：离心加速度和重力加速度的比值。

第14页：2）碟片式离心机disk-bowlc

• entrifuge
• 是在管式离心机的基础上发展起来的，在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。
• 是生物工业中应用最为广泛的一种离心机
• 有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60~100゜锥形碟片。
• 碟片间的距离一般为0.5-2.5mm

第15页：碟片式离心机工作原理

• 当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，
• 其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后在离心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向转子外围下滑，
• 而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心流动，然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的

第16页：碟片式离心机类型

• 人工排渣的碟片离心机
• 碟片上不开孔，只有一个清液排出口。沉积在转鼓内壁上的沉渣，间歇排出。只适用于固体颗粒含量很少的悬浮液。
• 喷嘴排渣的碟片离心机：当固体颗粒含量较多时，可采用具有喷嘴排渣的碟式离心沉降机。在有特殊形状内壁的转鼓壁上开设若干喷嘴
• 活门（活塞）排渣的碟片离心机这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%~30%,故可使分离因素达15000左右，可用于酶制剂，疫苗和胰岛素等生产中分离物的澄清。

第17页：是一类结构最简单的实验室常用离心机

• 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；
• 角度越大，沉降越结实，分离效果越好，
• 角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。
• 颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。3）斜角式离心机

第18页：斜角式离心机

• 结构稳定，
• 可装载较多的样品
• 使用较高的转速。
• 加速或减速时，对样品有搅动。
• 有些梯度离心要求用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差．

第19页：平抛式离心机一类结构简单的实验室常用

• 的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。
• 转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200—800rpm）。
• 颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。
• 样品便于收集
• 受振动和变速搅乱后对流现象小，
• 但转头结构复杂，最高转速相对要低
• 容量也小一些。4）平抛式离心机

第20页：平抛式离心机转子

平抛式离心机转子

第21页：5）螺旋式离心机scroll-typ

• e centrifuge
• 连续操作的沉降设备。
• 转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。
• 有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300℃
• 用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。

第22页：螺旋式离心机工作原理

• 转鼓与螺旋以一定差速同向高速旋转，悬浮液通过螺旋输送器的空心轴进入机内中部，由进料管连续引入螺旋内筒，加速后进入转鼓。
• 在离心力场作用下，固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，
• 较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。

第23页：6）多室式multichamberc

• entrifuge
• 多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室
• 加长了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。
• 同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离液经溢流排出。
• 常用于抗菌素液－液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。

第24页：结构：转鼓滤饼滤布滤网离心过滤机工作

• 原理图转鼓(上有小孔，亦称悬框)；
• 滤网；
• 滤布；机架。
• 原理：由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤网及滤筐而流出。7）离心过滤机（centrifugal filter）

第25页：三、过滤filtration过滤操作是借

• 助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。
• 过滤介质filter medium:过滤采用的多孔物质；
• 滤浆filter pulp:所处理的悬浮液；
• 滤液filtrate:通过多孔通道的液体；
• 滤饼或滤渣filter cake:被截留的固体物质。

第26页：滤饼过滤

• 当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。
• 在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用
• 适合于固体含量大于0.1%的悬浮液的过滤分离。

第27页：过滤推动力

• 悬浮液自身压强差、重力
• 悬浮液的—外加压力
• 过滤介质的—抽真空
• 离心力
• 过滤阻力：
• 介质阻力：可视为平变，且一般过滤初较明显
• 滤饼阻力:滤饼厚度：随过滤进行而增加滤饼特性：颗粒形状、大小。
• 大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。

第28页：滤饼的质量比阻

• 衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB，它表示单位滤饼厚度的阻力系数。
• 与滤饼的结构特性有关。对于不可压缩性滤饼，rB为常数，但对于可压缩性滤饼，rB是操作压力差的函数：
• rB＝r(ΔP)m（14-3）
• r-不可压缩滤渣的比阻，对于一定的料液为常数；m-压缩性指数，一般取0.5-0.8，对不可压缩性滤饼m为0。
• 可压缩滤饼:形成的滤饼刚性不足，其内部空隙结构随着滤饼的增厚或压差的增大而变形，空隙率减小.

第29页：滤饼的质量比阻与过滤关系

• 滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。
• 开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地，逐步地升高压力，一般在相当长的时间内，压力差不要超过0.05 MPa，最后的压差也不超过0.3－0.4 MPa。
• 若操作压力控制过高，由于比阻值的急剧增加，会使过滤速度很快下降，以至达到不能继续过滤的程度。

第30页：恒压下的过滤方程

• 恒压下，可压缩性滤饼的比阻应为常数。如过滤介质的阻力相对较小可以忽略不计，
• q—到瞬间τ，通过单位过滤面积的滤液量，m3；
• ΔP—压力差，Pa；
• μ—滤液粘度，Pa·s；
• rB—滤饼的重量比阻，m/kg；
• XB—通过单位体积滤液所形成的滤渣重量(干重),kg／m3；
• τ—过滤时间，s

第31页：过滤速度的强化1．

• 降低滤饼比阻力rB
• 一切能够降低rB的方法：如添加电解质、絮凝剂、凝固剂助滤剂等。2．降低滤液黏度μ
• 黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调PH、选择合适的放罐时间。3．降低悬浮液中悬浮固体的浓度
• 过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。4.对发酵液进行预处理，改善滤液性质。

第32页：质量比阻的计算

• 质量比阻可根据式14－4，利用图解法求得。以τ/q为纵轴，以q为横轴所得的直线斜率为M，则rB可按下式计算：根据滤饼的质量比阻值，可衡量各种不同发酵液过滤的难易程度。
• 真菌的菌丝比较粗大,如青霉素的重量比阻为(0.15一0.20)xl012m/kg左右，发酵液容易过滤。
• 放线菌发酵液菌丝细而分枝,交织成网络状,如链霉素重量比阻为2000x1012m/kg左右,过滤较困难,一般需经预处理。
• 细菌发酵液的菌体更细小，质量比阻值更大，直接过滤十分困难。

第33页：过滤介质选择

• 过滤介质起过滤作用，还是滤饼的支撑物。应具有足够的机械强度和尽可能小的流动阻力。合理选择过滤介质：
• 过滤介质所能截留的固体粒子大小：通常以过滤介质的孔径表示。常用的过滤介质中，纤维滤布所能截留的最小粒子约10μm，硅藻土为lμm，超滤膜可小于0.5μm。
• 过滤介质的透过性：是指在一定的压力差下，单位时间单位过滤面积上通过滤液的体积量，它取决于过滤介质上毛细孔径的大小及数目。

第34页：过滤介质-织物介质

• 又称滤布，应用最广泛，包括由棉、麻等天然纤维滤布和合成纤维滤布。
• 其过滤性能受许多因素的影响，其中最重要的是纤维的特性、编织纹法和线型。耐磨吸水率％密度(kg／m3)最高温度℃良优优16-226.5-8.30.04-0.0815511413892105—120145棉尼纶涤纶堵孔倾向寿命滤饼脱落滤饼中含水阻力滤液澄清度依次易中长短依次易依次减依次降依次降平纹斜纹缎纹

第35页：过滤介质-粒状介质

• 有硅藻土、珍珠岩粉、细砂、活性炭、白土等。
• 最常用的是硅藻土，是优良的过滤介质：
• ①一般不与酸碱反应，化学性能稳定；
• ②形状不规则，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；
• ③无毒且不可压缩，形成的过滤层阻力不随操作压力变化。
• 硅藻土过滤介质通常有三种用法：
• （1）作为深层过滤介质。硅藻土过滤层具有曲折的毛细孔道，借筛分、吸附和深层效应作用除去悬浮液中的固体粒子，截留效果可达到1μm。
• （2）作为预涂层。在支持介质的表面上预先形成一层较薄的硅藻土预涂层，用以保护支持介质的毛细孔道不被滤饼层中的固体粒子堵塞。
• （3）用作助滤剂。

第36页：过滤介质-多孔固体介质

如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板状或管状，孔隙很小且耐腐蚀，常用于过滤含有少量微粒的悬浮液。

第37页：典型过滤设备

• 按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机
• 按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤
• 实验室用抽滤装置
• 板框压滤机（间歇操作）
• 转筒真空过滤机（连续操作）
• 过滤式离心机固液分离过滤设备

第38页：1）实验室用抽滤装置

1）实验室用抽滤装置

第39页：2）板框压滤机plate and f

• rame filter
• 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。

第40页：板框压滤机

包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。

第41页：板框式压滤机在过滤时

悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。

第42页：板框压滤机优点过滤面积大

结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。

第43页：自动板框式压滤机

• 自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。
• 自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。

第44页：）真空转鼓过滤机

（rotary-drum vacuum filter）真空过滤设备以大气与真空之间的压力差作为过滤操作的推动力。生物工业中，用得较多的是转筒式真空过滤机和带式真空过滤机。转筒真空过滤机的结构转筒真空过滤机是一种连续操作的过滤设备，设备的主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒，表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿径向被筋板分隔成若干个空间。

第45页：转筒真空过滤机结构

• 转筒，扇形格(18格)；
• 滤室；
• 分配头；
• 动盘(18个孔，分别与扇形格的18个通道相连)；
• 定盘(三个凹槽：滤液真空凹槽、洗水真空凹槽、压缩空气凹槽，分别将动盘的18个孔道分成三个通道)；滤浆槽。工作过程

第46页：转筒下部浸入滤浆槽中

浸没角约900-1300，圆筒缓慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区，卸渣及再生区3个区域。

第47页：转筒真空过滤机 优点

• 转筒真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小，缺点：
• 辅助设备多，投资大，
• 且由于真空过滤，推动力小（不超过8×104Pa），滤饼湿度大（20％～30％）。
• 主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。

第48页：带式真空过滤机

带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。

第49页：进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤

• 带式真空过滤机流程
• 1、进料→过滤→滤饼洗涤→吸干→卸料→滤布清洗连续进行，配有PLC控制，自动化程度高。2、真空过滤盘分段设计，可满足不同物料过滤、洗涤、吸干的工艺要求，滤带运行速度采用变频无级调速，对不同物料有广泛的适应性。
• 3、在同一设备上可采用多次逆流洗涤得到高浓度的滤液，也可采用并流洗涤或顺流洗涤获得高纯度的滤饼。

第50页：适用性特点过程

• 主要结构设备应用广泛。对原料的适应性强
• 加压过滤，推动力较大
• 结构简单，造价低；
• 过滤面积大，能耗少；
• 间歇操作；
• 洗涤时间长，生产效率低。装合过滤洗涤卸渣整理滤板/滤框/夹紧机构/机架板框压滤机适于粒度中等，粘度不太大的物料
• 连续化生产，自动化程度高
• 真空过滤，推动力较小；，
• 滤饼湿度大，设备投资高过滤洗涤吹干卸渣转筒(滤网、滤布)/分配头、滤浆槽转鼓真空过滤机应用广泛，过滤面积小。
• 离心过滤，推动力最大；
• 滤液湿度小，设备成本高，过滤洗涤卸渣转鼓(滤网、滤布)/机架离心过滤机几种过滤设备的比较

第51页：5）硅藻土过滤机diatomite

• filter
• 硅藻土中的硅藻有许多不同的形状，由于硅藻土具有细腻、松散、质轻、多孔、吸水和渗透性强的特性，所以它是一种性能优良的工业滤剂。
• 硅藻土过滤是以硅藻土作为过滤介质，它是一种预涂型过滤器，预涂、过滤、反冲洗是硅藻土过滤的一般工艺过程。
• 在酿造、饮料、酒类和水处理等方面得到广泛应用。目前，国内主要用于酒类和饮料过滤

第52页：三、过滤

硅藻

第53页：硅藻土过滤机

硅藻土过滤机

第54页：６）错流过滤

又称切向流过滤（Cross-Flow Filtration）传统过滤时过滤液体垂直于过滤介质，过滤阻力主要来之滤饼。错流过滤打破了传统过滤的机制，即液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度

第55页：错流过滤 微滤过程示意图

料液快速经过薄膜,以减少形成滤饼

第56页：朗极化工公司膜澄清过滤和膜浓缩的“错

流过滤系统”陶瓷膜错流过滤

第57页：错流过滤

特点收率高（97-98%）质量好减少处理步聚染菌罐也能进行处理介质阻力大不能得到干滤饼需要大的膜面积目前适用于小分子的分离

第58页：全发酵液提取

• 一种新型的生物分离技术概念被提出：集成化分离技术，即对已有的两种或两种以上的单元操作进行有效的组合，组成一种有效的单元操作，以达到提高产品收率、缩短纯化步骤、降低纯化费用和投资成本的目的。
• 1.用离子交换法进行全发酵液提取
• 2.用膜技术进行全发酵液提取
• 3.用双水相萃取进行全发酵液提取
• 4.用扩张床吸附进行全发酵液提取

第59页：四、细胞破碎

• （cell disruption)不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液
• 植物细胞多为胞内产物
• 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。
• 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。
• 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。

第60页：概述细胞破碎技术

概述细胞破碎技术

是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。

第61页：细胞壁结构对破碎

1、细胞壁结构对破碎的影响微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。

第62页：霉菌酵母菌革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细

菌微生物100-250nm100-300nm10-13 nm20-80 nm壁厚多层多层多层单层层次多聚糖(80-90%)脂类蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)主要组成细胞壁的组成和结构真菌酵母菌革兰氏阴性细菌革兰氏阳性细菌微生物100-250nm100-300nm10-13 nm20-80 nm壁厚多层多层多层单层层次多聚糖(80-90%)脂类蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)主要组成细胞壁的组成和结构

第63页：植物细胞壁的结构

• 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。
• 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。
• 由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。
• 它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。

第64页：植物次生细胞壁某些植物细胞

• 当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。
• 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。

第65页：细胞破碎的方法 研磨

2、细胞破碎的方法 研磨

第66页：机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理

破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理

第67页：一机械法机械破碎法又可

分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）

第68页：采用高压匀浆器

（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。

第69页：

第70页：高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多

WAB公司的AVP Gaulin 31MR型Bran and luebbe公司SHL40型意大利Niro Soavi 高压匀浆机

第71页：高压匀浆法使用时注意事项

• 高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
• 可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。
• 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。

第72页：高压匀浆法适用的范围—大规模细胞破碎

• 的常用方法☆高压匀浆法适用的范围：
• 酵母和大多数细菌细胞的破碎；
• 料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用高压匀浆法。
• 易造成堵塞的团状或丝状真菌，
• 较小的革兰氏阳性菌，
• 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）

第73页：影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细

胞分率符合如下公式：ln[1/(1-R)]=KNPɑ式中R—破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K－与温度有关的速度常数；P－操作压力，MPa；ɑ－与微生物种类有关的常数。与操作压力正相关

第74页：升高压力有利于破碎

• 减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。
• 但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p超生一定值时，R增加但很慢。
• 在工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。
• 破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。 影响高压匀浆器细胞破碎因素

第75页：高压匀浆法-X-挤压器

• 改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。
• 细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。
• 主要用于实验室中。
• 优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高
• 对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。

第76页：2）珠磨法bead mill

• 珠磨是常用的方法
• 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。
• 在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 WSK卧式高效全能珠磨机

第77页：高速珠磨机工作原理

• 磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；
• 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起
• 在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。
• 由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。

第78页：Netzsch LM-20型珠磨机

• A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口
• 园盘以两种位置交错地安装在轴上，
• 一种处于径向，一种与轴倾斜，
• 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。
• 由于交错的运动，提高了破碎效率。

第79页：珠磨机破碎作用方程

• 破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：ln[1/(1-R)]=Kt 15-2
• R—破碎率；K一一级反应速度常数；t一时间。
• K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。

第80页：3）超声波破碎

• 超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
• 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。
• 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。

第81页：超声波破碎的机理

一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。 JY92-II D超声波细胞粉碎机

第82页：超声波破碎的适用范围

• 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。
• 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。
• 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。
• 超声波破碎的有效能量利用率极低
• 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。

第83页：举例成本效果原理技术细胞悬浮液大规模

处理适中剧烈须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎匀浆法(孔型)细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理便宜剧烈细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠磨破碎法细胞悬浮液小规模处理昂贵适中用超声波的空穴作用使细胞破碎超声波法便宜适中细胞被研磨物磨碎研磨法动物组织及动物细胞适中适中细胞被搅拌器劈碎匀浆法(片型) 不同机械破碎方法的比较

第84页：非机械破碎方法酶溶破碎法

（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）去垢剂破碎法（detergents）渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）

第85页：二非机械法非机械方法很多1酶解2化学

• 法溶胞3物理法
• 渗透压冲击
• 冻结和融化
• 干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。 二

第86页：酶解（酶溶法Enymatic

lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法 常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等

第87页：根据胞壁成分不同

用不同的外加酶 溶菌酶（β-1,4糖苷键）革兰氏阳性菌、放线菌溶菌酶+EDTA革兰氏阴性菌细胞壁溶解酶zymolyase、甘露糖酶、b-1,6-葡聚糖酶、蜗牛酶酵母、真菌纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶植物细胞壁

第88页：外加酶法

• 酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。
• 溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。
• 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，
• 酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。
• 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。

第89页：外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生

更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。

第90页：酶解法

• 的特点优点：
• 发生酶解的条件温和
• 能选择性地释放产物
• 胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整 缺点：
• 溶酶价格高，
• 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)
• 产物抑制的存在。

第91页：酶解-自溶作用

• 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。
• 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。
• 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。
• 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。

第92页：酸碱以及某些化学试剂

如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2化学渗透法该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。

第93页：酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸

• 通常采用6mol/L HCl。
• 碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。 （1）酸、碱处理法

第94页：细胞破碎常用的表面活性剂

十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2）化学试剂处理法无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解表面活性剂法

第95页：能分解细胞壁中的磷脂

使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂EDTA螯合剂处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。

第96页：通用性差

• ；
• 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；
• 有些化学试剂有毒。
• 化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度化学渗透法特点：缺点
• 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；
• 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。优点

第97页：物理法

• 渗透压冲击法
• 冻结-融化法
• 干燥法

第98页：1）渗透压冲击法渗透压冲击是较温

和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。

第99页：2）冻结-融化法将细胞放在低温下冷

冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。

第100页：使细胞结合水分丧失

• 从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。
• 气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；
• 真空干燥多用于细菌。
• 冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥

第101页：

第102页：选择破碎方法的依据

• 细胞处理量；
• 细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；
• 目标产物对破碎条件的敏感性；
• 破碎程度；
• 目标产物的选择性释放

第103页：选择性释放目标产物

• 的一般原则⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围
• 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结－融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法．
• 当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。

第104页：破碎技术的研究方向1

)多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合

第105页：破碎技术的研究方向-与上游过程相结合

• 在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。
• 在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂(如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；
• 选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；
• 用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。

第106页：（inclusion bod

• ies IBs)基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。胞内表达：
• 胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化
• 胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。
• 不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。

第107页：外源蛋白在大肠杆菌中的积累外源蛋白

的积累产物占菌体总蛋白蛋白形成包涵体50%人胰岛素在细胞间区20%β-丙酰胺酶形成包涵体25%γ-人体干扰素形成包涵体凝乳酶原形成包涵体>30%牛生长激素形成间区包涵体β-内酰胺酶形成包涵体5%~26%人胰岛素原

第108页：包涵体

一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。包含体的构成

第109页：基因工程包涵体的纯化方法 收集菌体细

胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。

第110页：包涵体获得几种常见的工艺路线

(一) 机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）离心提取包含体加变性剂溶解除变性剂复性