07 第6章 核酸类物质的积累机制.pptx

第1页：第六章核酸类物质的积累机制

第六章核酸类物质的积累机制

第2页：核酸发酵是在氨基酸发酵基础上的进一步

深化和发展的代谢控制发酵，即以代谢控制理论为依据，设法造就（选育）从遗传角度解除了正常代谢控制机制的突变株。

第3页：含义名称带碱性的有机化合物

嘌呤和嘧啶的衍生物。DNA：AGTC；RNA：AGUC。碱基Base碱基+五碳糖（核糖或脱氧核糖）。DNA脱氧核糖，RNA核糖核苷Nucleoside碱基+五碳糖+磷酸。核苷酸Nucleotide由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，生命的最基本物质之一。DNA和RNA核酸Nucleic acid基本概念核酸类物质的概述

第4页：Adenine---腺嘌呤Thymi

ne---胸腺嘧啶Cytosine---胞嘧啶Guanine---鸟嘌呤Uracil---尿嘧啶碱基结构核酸类物质的概述

第5页：ase碱基、核苷、核苷酸、核酸的结构

关系图

第6页：核酸类物质的概述

核酸类物质的概述

第7页：核酸类物质的概述

核酸类物质的概述

第8页：许多单核苷酸也

具有多种重要的生物学功能，如与能量代谢有关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。某些核苷酸的类似物能干扰核苷酸代谢，可作为抗癌药物。5-氟尿嘧啶：抗肿瘤药物叠氮胸苷：抗病毒，HIV治疗药物核酸类物质的概述

第9页：核酸类物质的生产现状

• 1868年，Miescher从浓血细胞的细胞核中发现核酸物质。20世纪40年代对核酸分子的结构认识及其在生命活动中的作用有重大突破。
• 1913年日本小玉新太郎发现干松鱼的鲜味是因含有5′-肌苷酸而引起。1960年日本又发现5′-鸟苷酸的呈味效果，继而发现呈味核苷酸与谷氨酸钠（味精）并用时，对谷氨酸钠具有强烈的助鲜效果。此后不久，日本对5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸进行工业化生产，80年代年产量已达4000吨左右。
• 中国80年代后对核酸制品生产开展研究工作，年产5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸能力为50～80吨。目前预计年产量在300吨。

第10页：核酸类产品的应用食品添加剂

2、核酸类产品的应用食品添加剂：强化食品风味，对咸、酸、苦、腥味等有消杀作用。以5‘-鸟苷酸（GMP)、5’-肌苷酸(IMP)和5‘-黄苷酸(XMP)及其二钠盐为代表。功能食品添加剂：婴儿乳制品中添加，可增强婴儿的免疫功能，减少婴儿腹泻的发生。近年来欧美、日本已在婴儿奶粉中添加核苷酸(推荐用量为72mg/L)，这对于提高婴儿免疫力十分有效（人奶与牛奶的区别）。

第11页：临床治疗药物

• 8-氮鸟嘌呤和6-巯基嘌呤与抗生素类似，并可抑制癌细胞生长；9-β-D阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞用于治疗疱疹；阿糖胞苷、阿糖腺苷可治疗急性白血病，具有抗癌和抗病毒功效。S-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具消炎镇痛作用。2005年版《中国药典》收载的核苷酸与核苷类原料药17种(表1)，制剂40种。
• 药物中间体：5‘-AMP可用于制造ATP、环AMP、S-腺苷甲硫氨酸等生化药物产品，5’-CMP用于制造胞二磷胆碱、CTP、阿糖胞苷、聚肌胞等生化药物；5'-UMP参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸苷的生化合成，具有重要生理作用，还可制造UTP、聚腺尿、UDP-葡萄糖等药物。
• 农业方面：用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾，可以提高农作物的产量。

第12页：用途估计年产量

(T/Y)名称食品添加剂30005'-IMP(肌苷酸)食品添加剂20005'-GMP(鸟苷酸)心脏病500Inosine(肌苷)强心剂4胞苷二磷酸-胆碱肌肉营养不良200ATP(三磷酸腺苷)肝或肾病少量生产FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)肝或肾病少量生产NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)白细胞减少少量生产腺嘌呤冠状缺陷、咽炎、高血压和动脉硬化少量生产腺苷循环系统疾病、风湿病少量生产5'-AMP(腺苷单磷酸)糖尿病、气喘、癌症少量生产CAMP(环腺苷单磷酸)肝病少量生产乳清酸癌症少量生产6-蛋尿苷

第13页：核酸类产品的生产方法1.化学合成法

工艺复杂，设备条件要求高。2.核糖核酸（ribonucleic acid,简称RNA）水解法：酶法和化学用糖质原料或亚硫酸制浆废液等制备酵母菌体，从菌体中分离出RNA，水解RNA，得到5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸。制备RNA的原料，以酵母菌最为实用,产朊假丝酵母、酿酒酵母等酵母。工业生产上以2％热食盐水从其菌体中抽提出RNA最为简便。RNA含量为干菌体的10-15％。

第14页：

第15页：用化学法水解RNA

3.用化学法水解RNA：若以氢氧化钙作水解剂，则几乎全部水解成核苷，分离所得到的核苷，再用化学法使其磷酸化，可制得5′-肌苷酸、5′-鸟苷酸。4.酶法水解：采用的5′-磷酸二酯酶,在橘青霉和金色链霉菌存在此种酶。培养这些菌株作为酶源。酶解RNA产物为5′-腺苷酸、5′-鸟苷酸、5′-胞苷酸、5′-尿苷酸混合物。还需采用米曲霉产生的5′-腺苷酸脱氨酶将混合物中的5′-腺苷酸脱氨生成5′-肌苷酸。

第16页：发酵法和化学法相结合的方法

5.发酵法和化学法相结合的方法：采用微生物发酵方法,生产核苷,再经化学磷酸化，得到5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸。采用枯草杆菌、产氨短杆菌、短小芽孢杆菌的腺嘌呤营养缺陷型发酵生产肌苷，再用化学法使其磷酸化得到5′-肌苷酸。亦可采用对抗菌素有抗性的枯草杆菌突变株发酵生产鸟苷,同样再经化学磷酸化,生成5′-鸟苷酸。

第17页：直接发酵法

6.直接发酵法：利用微生物发酵直接生产5'-肌苷酸、5'-黄苷酸。以葡萄糖为原料发酵生产5'-核苷酸，必须解决使所生成的核苷酸透过细胞膜和不使生成的核苷酸分解成核酸碱基和核苷的问题，现根据代谢调控机制选育出的菌株，已解决此问题。采用对锰离子不敏感的产氨短杆菌突变株，直接发酵生产5'-肌苷酸，产率达20g/L。亦可采用产氨短杆菌突变株直接发酵高产5'-黄苷酸，进而再由其他突变株或用酶法进一步将5′-黄苷酸转化为5'-鸟苷酸。

第18页：第一节核苷酸的生物合成途径核苷酸的生物

合成有两条不同途径：①全合成途径：从磷酸核糖开始，逐步加上必要的成分，最后闭合成环（嘌呤或嘧啶环）。②补救途径（分段合成）：从培养基中吸取嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、磷酸，通过一系列酶的作用合成核苷酸。

第19页：一、嘌呤核苷酸的合成途径

（一）全合成途径：通过利用一些简单的前体物，如5-磷酸核糖，氨基酸，一碳单位及CO2等，逐步合成嘌呤核苷酸的过程称为从头合成途径。这一途径主要见于肝脏，其次为小肠和胸腺。

第20页：合成步骤

可分为三个阶段：1、次黄嘌呤核苷酸的合成：首先在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下，消耗ATP，由5‘-磷酸核糖合成PRPP(1’-焦磷酸-5‘-磷酸核糖)。然后再经过大约10步反应，合成第一个嘌呤核苷酸—次黄苷酸（IMP）。磷酸核糖焦磷酸合成酶5‘-磷酸核糖PRPP→→→→IMPATP

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第23页：腺苷酸及鸟苷酸的合成

2、腺苷酸及鸟苷酸的合成：IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下，由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸（AMP-S），然后裂解产生AMP；IMP也可在IMP脱氢酶的催化下，以NAD+为受氢体，脱氢氧化为黄苷酸（XMP），后者再在鸟苷酸合成酶催化下，由谷氨酰胺提供氨基合成鸟苷酸（GMP）。AMP-S AMPIMPXMP GMP 枯草杆菌产氨短杆菌

第24页：

第25页：三磷酸嘌呤核苷酸的合成

3、三磷酸嘌呤核苷酸的合成：

第26页：嘌呤核苷酸生物合成过程

• 的特点：
• ①合成过程是在5’－磷酸核糖基础上进行的；
• ②组成嘌呤环的各元素是逐个垒加到核糖的C1上去的，先合成咪唑环，随着嘌呤环的生成，5’-核苷酸应运而生。第一个被合成的核苷酸是IMP。
• ③AMP、GMP是由IMP转化而生成的。

第27页：嘌呤环上各原子的来源来自谷氨酰胺的酰

胺氮来自“甲酸盐”来自天冬氨酸来自甘氨酸来自CO2来自“甲酸盐” 采用同位素标记法

第28页：（二）补救合成途径

又称再利用合成途径。指利用分解代谢产生的自由嘌呤碱合成嘌呤核苷酸的过程。这一途径可在大多数组织细胞中进行。其反应为：核苷酸磷酸化酶：Base+1-PR核苷+Pi核苷酸焦磷酸化酶：Base+ PRPP 5’-核苷酸+ PPi核苷酸磷酸激酶:Base + ATP 5’-核苷酸+ ADP

第29页：HGPRT活性高APRT活性低

HGPRT活性高APRT活性低

第30页：二、嘧啶核苷酸的合成途径两条途径

一条全合成途径（主要途径）:是在尚未完成的嘧啶环上接上磷酸核糖，然后再转变为嘧啶核苷酸一条补救途径:是由已经完成的嘧啶来合成核苷酸。

第31页：全合成途径

①首先以CO2和谷氨酰胺为原料合成氨基甲酰磷酸②氨甲酰磷酸与天冬氨酸缩合生成氨甲酰天冬氨酸，再脱水、脱氨生成乳清酸③乳清酸接受PRPP的5’-磷酸核糖生成乳清酸核苷酸，再进一步脱羧生成尿嘧啶核苷酸（UMP），可由激酶催化和ATP提供高能键而生成UDP和UTPUMP可经由氨基化生成胞嘧啶核苷酸（CMP）。

第32页：嘧啶核苷酸

的主要合成步骤为：1、尿苷酸的合成：在氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ的催化下，以Gln，CO2，ATP为原料合成氨基甲酰磷酸。后者在天冬氨酸转氨甲酰酶的催化下，转移一分子天冬氨酸，从而合成氨甲酰天冬氨酸，然后再经脱氢、脱羧、环化等反应，合成第一个嘧啶核苷酸，即UMP。Gln+CO2+2ATP氨基甲酰磷酸氨甲酰天冬氨酸乳清酸UMP

第33页：

第34页：嘧啶核苷酸的嘧啶环是由氨甲酰磷酸和天

冬氨酸合成的。氨甲酰磷酸天冬氨酸

第35页：胞苷酸的合成

胞苷酸的合成

第36页：脱氧嘧啶核苷酸的合成

脱氧嘧啶核苷酸的合成

第37页：（二）补救合成途径

由分解代谢产生的嘧啶/嘧啶核苷转变为嘧啶核苷酸的过程称为补救合成途径(salvagepathway)。以嘧啶核苷的补救合成途径较重要。

第38页：

第39页：核苷酸的合成及相互关系

核苷酸的合成及相互关系

第40页：IMP合成系的代谢控制及嘌呤核苷酸互

变的代谢控制第二节嘌呤核苷酸的代谢调节机制（枯草杆菌型）AMP脱氨酶SAMP裂解酶SAMP合成酶IMP脱氢酶GMP还原酶XMP氨化酶（5-磷酸核糖胺）AICAR（5-胺基-4-氨甲酰咪唑核苷酸）

第41页：

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第43页：嘌呤核苷酸相互转换系的代谢控制调节位

点A①②③④⑤⑥PR-ATP1-（5'-磷酸核糖基）-三磷酸腺苷⑥AMP脱氨酶⑤SAMP裂解酶④SAMP合成酶③XMP氨化酶②GMP还原酶①IMP脱氢酶AICAR－5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷酸PRA-（5-磷酸核糖胺）磷酸核糖酰胺转移酶

第44页：嘌呤核苷酸的从头合成受到产物的反馈控

制。第一个控制点是由5-磷酸核糖转变为磷酸核糖焦磷酸（PRPP），由核糖磷酸焦磷酸激酶催化。PRPP合成酶受ADP、ATP、GTP、UTP抑制。第二个控制点是PRPP接受谷氨酰胺的氨基转变为5，-磷酸核糖胺（PRA），磷酸核糖酰胺转移酶受到ADP、ATP、AMP、GTP、GDP、GMP的反馈抑制。其中ADP、ATP、AMP结合在酶的一个抑制位点，而GTP、GDP、GMP结合在另一抑制位点。

第45页：IMP是AMP、GMP合成途径的分

支点，每条分支途径的第一步反应也是控制点，GMP反馈抑制IMP向XMP转变，AMP则反馈抑制IMP转变为腺苷琥珀酸，从而防止生成过多的AMP和GMP。GTP加速IMP向AMP转变，而ATP则可促进GMP的生成。这样可使酰嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的水平保持相对平衡，满足核酸合成的需要。

第46页：以IMP为中心的两个循环

各个反应是不可逆的IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，也被GMP阻遏；ATP反馈抑制GMP还原酶。同样的，AMP抑制SAMP合成酶，GTP抑制AMP脱氨酶SAMP→AMP反应的供能体为GTP，XMP→GMP反应的供能体为ATP（即GTP加速IMP向AMP转变；ATP则促进GMP生成）总结

第47页：根据上述调节机制

当细胞中的GMP水平提高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地转向AMP方面；反之，当细胞的AMP水平高到一定程度时，从IMP的代谢流就自动地转向GMP方面。另一方面，核苷酸的代谢也与组氨酸的生物合成有关：AICAR→IMP→AMP→ATP→PR-ATP→AICAR形成一个循环，由PRATP经咪唑甘油磷酸生成组氨酸。假如组氨酸过剩，则不走此途径。

第48页：一、肌苷酸

（IMP）：次黄嘌呤核苷酸，白色粉末状或颗粒状结晶，味鲜、易溶于水，难溶于有机溶剂。食品：鲜味添加剂医药：白细胞或血小板减少症，各种急慢性肝炎，肺原性心脏病，中心性视网膜炎，视神经萎缩症，毛地黄中毒症以及血吸虫病的治疗。生产方法：微生物直接发酵生产（一步法）；细菌发酵生产肌苷，然后采用化学发或酶法进行磷酸化；添加前体物次黄嘌呤，通过补救途径合成（半合成法）；利用微生物发酵生产腺苷或5，－腺苷酸，再用化学法或酶法生产。第三节核酸类物质代谢调控实例

第49页：PRPP转氨酶受到AMP、ADP、A

TP和GMP反馈抑制，还受腺嘌呤的反馈阻遏。当使用腺嘌呤缺陷型（Ade－）突变株时，限制Ade添加量，既可以解除Ade系化合物对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，，而且避免了腺嘌呤对PRPP的反馈阻遏，为5’-IMP积累建立了首要条件。2、产氨短杆菌肌苷酸合成的代谢调控机制

第50页：PRPP转氨酶受到AMP、ADP、A

1、PRPP转氨酶受到AMP、ADP、ATP和GMP反馈抑制，还受腺嘌呤的反馈阻遏。2、IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，被鸟嘌呤阻遏3、SAMP合成酶受AMP、ADP、ATP的反馈调节

第51页：以腺嘌呤缺陷型

（丧失SAMP合成酶）为出发菌株再诱变成Xan－（黄嘌呤缺陷性，丧失IMP脱氢酶），不但切断了支路代谢，还可以通过限量添加Gua（鸟嘌呤）或Xan使GMP生成量减少，解除GMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制，保证肌苷酸大量积累。

第52页：肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型1

3、肌苷和肌苷酸高产菌的选育模型1）切断两条支路代谢，切断支路：IMP→SAMP→AMP；IMP→XMP，选育腺嘌呤缺陷型（Ade－）和黄嘌呤缺陷型（Xan－）的双重缺陷型突变株；2）通过限量腺嘌呤和鸟嘌呤来解除腺嘌呤系和鸟嘌呤系化合物对IMP生物合成的酶的反馈抑制；3）进一步选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤类似物和（或）抗磺胺剂突变株，从遗传上解除正常代谢控制；选育8-AGr（抗8-氮鸟嘌呤）突变株（选育抗性突变株时，应采用丧失腺嘌呤脱氢酶<dea－>的菌株为出发菌株）

第53页：4）选育Mn2+脱敏突变株

（MnINS），或控制培养基中Mn2+的浓度，解除细胞膜渗透型障碍。5）生产肌苷时，肌苷酸酶活性要强，而肌苷酸化酶要越弱越好，以使生成的肌苷不再分解。模型：Ade-+Xan-+dea-+GMPred-+ 8AGr（或8AXr、ARr）+SGr+NP-+ARr+Smr（符号见《微生物工程工艺原理》p.112）

第54页：IMP发酵应具备的条件

• 选择肌苷酸酶弱或丧失的出发菌株（不分解肌苷酸）
• 切断IMP向下的两条支路，使IMP大量生成和积累；
• 选育结构类似物双重抗性突变株；
• 限量添加Mn2+，解除细胞膜渗透型障碍。总结

第55页：核苷酸分泌

核苷酸不易分泌出胞外，实验证明Mn2+对产氨短杆菌核苷酸分泌起关键作用。Mn2+可引起细胞形态的变化，在IMP发酵中，控制Mn2+（限量）造成细胞膨胀的不规则形态，膜产生异常，非常专一性的膜透性被破坏，核苷酸生物合成补救途径酶系[PRPP激酶、Hx（次黄嘌呤）焦磷酸化酶]及Hx和R-5-P都分泌于体外，在体外大量生物合成IMP。但当Mn2+过量时，菌体呈小球状，抑制了这些物质的分泌。

第56页：二、鸟苷酸的发酵鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷

• 酸三部分组成。
• 1960年，日本科学家发现5‘－鸟苷酸钠具有强烈的鲜味。1961年又证实了香味极浓的著名菇类－香菇含有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMP的生产方法。

第57页：（1）由酵母细胞提取出核酸

• 鸟苷酸的生产方法：（1）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解；（2）直接发酵法生产鸟苷酸；（3）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷；（4）双菌混合发酵法。利用5
• 一黄苷酸或黄苷酸生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株混合培养。

第58页：（一）二步法

（常用）1.选用二步法的原因：（1）GMP的细胞膜透性很差（限Mn2+）微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷盐）,培养条件较复杂。（2）直接发酵法产酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。（3）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调节的强度，使积累鸟苷成为可能。

第59页：鸟苷生产菌的选育

2.鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件）（1）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺苷酸的通路。（2）鸟苷分解酶的活性微弱。（3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。（4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱变获得。