03 第2章 培养基制备与灭菌.pptx

第1页：第二章培养基的制备与灭菌纯种培养的基础

影响生长、代谢、产物合成与纯化

第2页：培养基的组成？如何选择培养基？

• 1、培养基的组成？如何选择培养基？
• 2、如何制备培养基？
• 3、如何对培养基进行灭菌？

第3页：第一节培养基的原材料

一、培养基的营养成分及用途光光能自养自养菌氢、硫、氨化能自养1.能源亚硝酸盐、亚铁盐碳水化合物等有机物异养菌石油天然气和石油化工产品（如醋酸）功能：生长、繁殖需要；

第4页：碳酸气2.碳源淀粉水解糖、糖蜜、亚硫

酸盐纸浆废液等石油、正构石蜡、天然气醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；

第5页：有机氮

黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、3.氮源酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等无机氮：尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐功能：构成菌体、含氮代谢物；

第6页：磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐4.无机盐

铁、锰、钴等微量元素功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；

第7页：磷核酸

蛋白质等的组成成分,许多辅酶和高能磷酸键的成分,氧化磷酸化的必需元素铁细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素,是菌体生命活动的必需元素之一;镁,锌,钴是某些酶的辅酶;钾影响细胞膜的通透性;钠具有维持细胞渗透压的作用;钙具有调节细胞的透性和调节培养液中磷酸盐含量的作用;

第8页：特殊生长因子

• 5.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等
• 功能：酶的辅助部分，维持生命活动；

第9页：发酵的添加剂发酵培养基中某些成分

6．发酵的添加剂发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂

第10页：1）、前体

• 指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
• 如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20 u/mL增加到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。

第11页：2）、促进剂

• 指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。
• 比如在酶制剂发酵过程中，加入诱导物、表面活性剂及其它一些产酶促进剂（比如吐温80、植酸、洗衣粉等）

第12页：3）、抑制剂

• 在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。
• 例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。

第13页：水分 功能

• 7.水分
• 功能：生化反应均在水溶液中进行

第14页：什么是培养基？

• 将各种营养物质配制成用来培养微生物的基质。
• 用以供给菌体生长、繁殖、代谢和合成代谢产物

第15页：二、培养基的类型1.依营养物质的来源分类

天然培养基，营养丰富，成分复杂合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）半合成培养基，用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品

第16页：依培养基的物理状态来分

2.依培养基的物理状态来分：固体、半固体、液体1）固体培养基：液体培养基+凝固剂A、凝固培养基：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基，如琼脂、明胶B、非可逆性凝固培养基：指有血清凝固成的固体培养基或由无机硅胶配成的凝固后即不能再融化的固体培养基C、天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基，如麸皮、米糠、木屑等D、滤膜：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜，把它制成圆片状覆盖再营养琼脂或浸有培养液的纤维衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。

第17页：德国科赫，固体

，德国科赫，固体

第18页：2）半固体培养基配置好的液体培养基中

加入0.5~0.8%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之微半固体培养基。主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等

第19页：3）液体培养基

；培养基中80～90%是水。

第20页：依培养基的用途来分1

3.依培养基的用途来分1）、孢子培养基2）、种子培养基3)、发酵培养基4）、补料培养基5）、加富培养基6）、选择培养基7）、鉴别培养基8）、增殖和保存培养基9）、富集培养基10）、测定培养基

第21页：三、发酵培养基的选择一

）、配置培养基的原则1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基2、注意各营养物质的浓度和配比3、调节适宜的物理化学条件4、根据培养微生物的目的配置5、尽量使用廉价易得的原料

第22页：生态模拟

1、生态模拟2、查阅文献3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方4、实验比较实验的规模一般由定性到定量，由小到大。发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理； 二）、配置培养基的方法

第23页：培养基配方举例LB培养基

(Luria-Bertani培养基，细菌培养基)酵母提取物5克，胰化蛋白胨10克，NaCl 10克，水1000毫升pH7.2～7.4，琼脂15～20克高氏一号培养基(放线菌培养基)可溶性淀粉20克，KNO31克，K2HPO40.5克，MgSO40.5克，NaCl 0.5克，FeSO40.01克，水1000毫升，琼脂15～20克，pH7.4～7.6PDA培养基（Potato Dextrose Agar，真菌培养基）马铃薯200克，葡萄糖20g，自来水1000毫升，pH自然，琼脂15～20克

第24页：察氏培养基

(培养霉菌用)蔗糖20克NaNO33克K2HPO41克KCl1克MgSO40.5克FeSO40.01克琼脂20克水1000毫升自然pH无氮培养基(培养自生固氮菌用)葡萄糖10克NaCl0.2克KH2PO40.2克CaSO4·2H2O0.1克MgSO40.2克CaCO35克琼脂20克水1000毫升自然pH伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用)蛋白胨10克K2HPO42克乳糖10克琼脂25克，水1000毫升，pH7.62％伊红水溶液2毫升0.5％美蓝水溶液2毫升将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。

第25页：四、原料转换及意义

• 1、方法：（1）碳源的节约和代用
• 使用稀薄培养基，适当降低碳氮比，严格控制放罐时残糖浓度；
• 改用废糖蜜、废葡萄糖母液和工业用葡萄糖来代替淀粉、糊精和食用葡萄糖等；
• 改革工艺，改进代谢控制方法；
• 提高生产菌种的发酵单位。
• 开拓新的原料资源和微生物资源，主要是野生植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇等代粮发酵资源。（2）进展：乙醇、醋酸代粮发酵

第26页：意义1

2.意义1）、节约用粮，减低单耗，提高发酵单位和总收率；2）、开拓新的原料资源和微生物资源

第27页：什么是微生物最易

• 利用的碳源？
• 淀粉、糖蜜、纤维素、……
• 淀粉：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉
• 淀粉的糖化→淀粉糖（淀粉水解糖液）
• 主要成分：葡萄糖、少量麦芽糖和其他二糖、低聚糖、复合糖类、原料带来的杂质（如蛋白质、脂肪等）及其分解产物
• 酸水解，酶水解

第28页：易被利用的淀粉水解产物

• 葡萄糖、麦芽糖及蛋白质、脂肪分解产物即氨基酸、脂肪酸等是微生物生长的营养物
• 不能被利用的淀粉水解产物：一些低聚糖类及复合糖类等杂质。

第29页：第二节淀粉水解糖的制备

一、淀粉水解糖的制备方法 酸水解酶解法（双酶法）酸酶结合水解法酸酶法酶酸法

第30页：酸解法

1、酸解法：定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法.优点：设备要求简单，水解时间短（20 min），设备生产能力大缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。

第31页：酶解法

• 2、酶解法：（双酶水解法）
• 定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：一是利用α－淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。二是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。

第32页：α-淀粉酶

• （液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）优点：1、反应条件温和。2、酶的专一性强，副反应少3、可在较高的淀粉乳浓度下水解4、糖液的营养物质丰富5、糖液色浅、较纯、无苦味、质量高，有利于糖液的精制
• 缺点：反应时间较长（从投料到糖化完毕需2－3天），要求的设备较多；需要具备有专门培养酶的条件；由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。

第33页：酸酶结合法酸酶法

3、酸酶结合法酸酶法：1.液化：+酸→糊精or低聚糖2.糖化：+糖化酶→葡萄糖酶酸法：1.液化：+a-淀粉酶→糊精or低聚糖2.糖化：+酸→葡萄糖

第34页：酸酶法

• 适用范围：颗粒较紧密的原料（如谷物淀粉）。
• 优点：酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。

第35页：酶酸法

• 适用范围：颗粒大小不一（如碎米淀粉等）的原料。
• 优点：能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产较易控制，时间短，而且酸水解pH稍高，可减少淀粉水解副反应的发生，糖液色泽较浅。

第36页：不同的制糖工艺所得糖化液质量差别很大

不同的制糖工艺所得糖化液质量差别很大

第37页：双酶法糖化程度最高葡糖含量高出糖率较

高原料单耗较小采用较高淀粉浓度，提高设备生产能力，节省酸、碱的消耗。

第38页：二、淀粉酸水解理论基础

• 淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生这：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。
• 复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。
• 分解反应：葡萄糖→羟甲基糠醛→有机酸、色素等

第39页：㈠淀粉的水解反应直链淀粉

聚合度<6000支链淀粉：支叉分子，支叉位置为α-1,6糖苷键，聚合度一般>6000。淀粉水解的概念：淀粉的颗粒结构破坏，α-1,4糖苷键及α-1,6糖苷键被切断，这种作用是在酸的催化进行的。

第40页：淀粉水解过程1.H＋＋H2O→H

1.淀粉水解过程1.H＋＋H2O→H3O＋（阳离子）2.H3O＋＋糖苷键氧原子→不稳定化合物（共轭酸）（Ⅰ）3.C1－O键断裂→C1正碳离子（Ⅱ）4.水分子＋C1结合，再使C1失去H+，完成糖苷键的水解过程。

第41页：淀粉水解的过程淀粉→糊精→低聚糖→麦

• 芽糖→葡萄糖糊精：若干种分子大于低聚糖的碳水化合物总称。性质：
• 有旋光性、还原性，能溶于水，不溶于酒清。
• 呈色反应：一般聚合度(葡萄糖单位)＞30－35时，呈蓝色；随着聚合度的降低：蓝色→暗紫→紫→红褐→暗红→红→浅红
• 糖化液的还原性：淀粉水解生成的葡萄糖、麦芽糖及低聚糖等具有还原性基团。

第42页：淀粉酸水解反应动力学反应速度常

2、淀粉酸水解反应动力学反应速度常数，由反应条件（如温度、酸度等）而定 .淀粉水解反应速度取决于三种物质的浓度2.属于单分子一级反应类型淀粉浓度

第43页：水解反应速度常

数k α----酸的活性常数，与酸种类有关cA----酸的摩尔浓度δ----多糖的水解性常数，多糖水解的难易程度λ----温度对水解的影响常数

第44页：影响淀粉酸水解的因素酸的种类

3、影响淀粉酸水解的因素酸的种类主要因素浓度（酸的浓度、淀粉的浓度）水解温度

第45页：（二）、葡萄糖的复合反应及其

影响因素复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。主要有异麦芽糖，龙胆二糖。

第46页：复合反应

• 的特点
• 可逆
• 反应进行的程度及所生成复合糖的种类因反应条件（如糖浓度、酸种类、酸浓度、温度等）而不同。

第47页：淀粉浓度

影响复合反应的因素：1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）：DE值＝还原糖/干物质×100％2、酸的影响：

第48页：（三）葡萄糖的分解反应及其

影响因素葡萄糖(<1%)5’-羟甲基糠醛乙酰丙酸,蚁酸,色素等影响因素：浓度、温度、pH值；

第49页：第三节糖蜜前处理

一、糖蜜的来源与特点 糖蜜，桔水，制糖时的结晶母液，制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。分为甘蔗糖蜜甜菜糖蜜

第50页：不同产地不同加工方法

影响甘蔗糖蜜的成分四川广东项目碳酸法亚硫酸法碳酸法82.0085.5485.78锤度（Bx）54.8050.8153.89全糖分%35.8029.7733.89蔗糖%19.0020.0020.00转化糖%59.0059.4062.78纯度%5.064.575.14非发酵性糖分%9.238.999.55非发酵性糖/全糖%7.511.069.91胶体%10.09.510.5酸度11.111.0610.28硫酸灰分%0.540.4650.485总氮量%0.120.5950.130磷酸（P2O5）%

第51页：糖蜜的分级

• 甘蔗糖蜜：棕黄色至黑褐色的均匀浓稠液体要求：无夹杂物，无异臭味，无发酵迹象，含糖分与微生物的数量不同而分为三级，各地区要求不同
• 四川内江糖厂的糖蜜按下列要求分三级：一级糖蜜：含糖分为58~65％；含微生物1.0~9.0万个／1克二级糖蜜：含糖分为52~58％；含微生物15~50万个／1克三级糖蜜：含糖分为46~52％；含微生物100~800万个／1克
• 广东顺德糖厂的糖蜜按下列要求分三级：一级糖蜜：含糖分为50％以上；二级糖蜜：含糖分为48——50％；三级糖蜜：含糖分为48％以下。

第52页：糖蜜特点 干物质浓度很大糖分高产酸细

• 菌多灰分与胶体物质很多
• 如果不预先进行处理，微生物是无法直接进行发酵的。因此必须进行预处理。

第53页：稀释、酸化、灭菌、澄清 稀释

发酵糖浓度的需要酸化：防止杂菌的繁殖，加速糖蜜中灰分与胶体物质沉淀，同时调整稀糖液的酸度，使适于酵母的生长。灭菌：糖蜜中常污染大量的微生物，大致包括野生酵母，白念球菌以及乳酸菌一类的产酸菌。为了防止糖液染菌需灭菌。澄清：糖蜜中含有很多的胶体物质、灰分和其它悬浮物质，它的存在对酵母的生长与酒精发酵均有害，故应当尽可能除去

第54页：二、糖蜜前处理的方法 、加酸通风沉淀法

（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx →加入0.2～0.3％浓硫酸，通入压缩空气1 h →静置澄清8h，取上清液。通风一方面可赶走SO2或NO2等有害气体以及挥发性酸和其他挥发物质；另一方面可增加糖液中的含氧量，提高糖液的溶氧系数，以利酵母的增殖。

第55页：加热加酸沉淀法

• 2、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）：
• 糖蜜加水稀释到40％→加适量硫酸调节pH值到4～4.5 →放入澄清槽加热至80～90℃，通风30min →保温70～80℃→ 8～12小时，取上清液。

第56页：添加絮凝剂澄清处理法

• 3、添加絮凝剂澄清处理法：
• 糖蜜稀释至30～40 Bx→加硫酸调pH 3～3.8→加热至90℃→添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），搅拌均匀→静置1小时，取上清液。

第57页：糖蜜使用的注意点

除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐

第58页：三、谷氨酸发酵糖蜜前处理1.糖蜜预处理法

活性炭处理法树脂处理法亚硝酸处理法2.添加化学药剂处理法添加青霉素法添加表面活性剂添加抗氧剂法 .追加糖蜜法4.营养缺陷型变异株法

第59页：第四节其他原料的处理

一、纤维素及发酵废液的处理（一）、利用纤维素废料生产生物柴油、单细胞蛋白稻草、麦秆、玉米的茎和叶、甘蔗渣、废纸等流程如下

第60页：纤维原料粉碎水解中和澄清过滤发酵罐培

养分离废液种子营养盐菌体浓缩磨碎干燥成品

第61页：（二）利用柠檬酸中和滤液生产酵母 酵母菌

种斜面一级种子二级种子离心分离中和废液盐酸调pH3.5发酵干燥粉碎包装二次废液用于发酵培养基的配置等

第62页：二、亚硫酸盐废液的处理

• （一）亚硫酸盐制浆废液生产酒精和蛋白质
• 1、亚硫酸盐纸浆废液生产酒精
• 2、亚硫酸盐纸浆废液发酵生产蛋白质
• 3、亚硫酸铵法非木材制浆废液培养单细胞蛋白（二）亚硫酸盐废液发酵生产乳酸
• 三、木屑水解液发酵生产衣康酸

第63页：第五节生长因子、前体和产物促进剂从广义

上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子

第64页：前体指某些化合物加入到发酵培养基中

能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。2、前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量

第65页：作用：前体有助于

提高产量和组份用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用存在转化率的问题例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时的转化率在46-90%之间例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）转化率为：0.6/(0.337*36/13.8)=68%

第66页：用法：前体使用时普遍采用流加的方法前

体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率

第67页：产物促进剂

3、产物促进剂所谓产物促进剂

是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

第68页：促进剂提高产量的机制还不完全清楚

• 其原因是多方面的。
• 有些促进剂本身是酶的诱导物；
• 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，
• 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；
• 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。

第69页：第六节培养基灭菌

一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消灭杂菌和防止杂菌污染 消毒达不到灭菌要求，灭菌可达到消毒的目的

第70页：纯种培养技术

• 要求单一菌种生长；
• 接种培养之前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加料、设备、管道等进行灭菌，杀灭所有杂菌。
• 对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体大量繁殖。

第71页：二、灭菌方法

干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）；1、干热灭菌法灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热主要用于保持干燥的物料、器具等

第72页：

第73页：湿热灭菌法借助蒸汽释放的热使微生物细

2、湿热灭菌法借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点：1)蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底3)蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌4)蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易缺点：1)设备费用高2)不能用于怕受潮的物料灭菌

第74页：

第75页：射线灭菌紫外线、高速电子流的阴极射线

3、射线灭菌紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线4.化学药品灭菌法1）第一大类：表面消毒剂高锰酸钾溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛37％、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类

第76页：（1）高锰酸钾溶液

使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，浓度为0.1%~0.25%。（2）漂白粉：①原理：次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对细菌和噬菌体均有效。②种类：低标准漂白粉（含30％有效氯）高标准漂白粉（含70％有效氯）商品次氯酸钠溶液（含15％有效氯）。③使用方法：配制成5％溶液；极细的雾沫喷洒于场地效果较好；并非所有噬菌体对漂白粉都敏感，应轮流用药。

第77页：（3）75％酒精溶液①原理

使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。②作用范围：对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀灭作用，但对细胞芽孢的杀灭能力较差。③用途：常用于皮肤和器具表面杀菌。（4）新洁尔灭和杜灭芬：属表面活性剂类洁净消毒剂①原理：它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白质变性。②作用范围：对营养细胞10分钟能杀灭，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。③用途于用法：一般用于器具和生产环境消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。使用浓度为0.25%。

第78页：（4）甲醛①原理

• 甲醛是强还原剂，与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基酸和蛋白质的变性有较强活性。②气态甲醛灭菌：
• 将多聚甲醛气化；
• 以2份37％甲醛溶液与1份KMnO4混合；
• 将37％甲醛溶液直接加热；③液态甲醛灭菌：
• 将37％甲醛溶液喷雾，可杀灭营养细胞，杀灭芽孢需要12小时，甚至更长时间④效果及影响因素
• 用气态甲醛与甲醛水溶液所产生的甲醛蒸气的灭菌效果基本相同。
• 在0-37℃，甲醛的灭菌效果差别不大，当温度上升或相对湿度在50％以上，可增加灭菌效果。⑤缺点
• 穿透力差
• 能刺激眼、鼻和咽喉粘膜，在使用时应注意对人体的危害。

第79页：（5）戊二醛

①④⑤分子式：CHO(CH2)3CHO②特点：只有在碱性条件（加入碳酸氢钠或碳酸钠）才具有杀死芽孢的能力。③用途及用法：常用的浓度为2％，用于器皿、仪器和工具等灭菌。广谱、高效、速效杀菌剂，使用范围正在逐渐扩大

第80页：（6）过氧乙酸

• ①特点：强氧化剂，沸点110℃，温度高于沸点时具有爆炸性，温度较低时分解生成乙酸和1／2分子氧。②用途及用法：
• 广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。它的水溶液、喷雾及蒸气都有杀菌作用。
• 使用浓度为0.02%-0.2%，亦有用1％-2％浓度。喷雾或蒸气灭菌浓度为0.1-0.2mg/L，相对湿度为80％时，灭菌效果较好。③过氧乙酸作杀菌剂的优点是：
• 浓度低至0.01%，几分钟内可杀死营养细胞；
• 温度低至－40℃仍有杀菌作用；
• 0.2%过氧乙酸对人体无害，亦无公害；
• 使用方便；
• 应用范围广泛。④缺点：
• 有腐蚀性；
• 储存中易分解而失效。

第81页：（8）焦碳酸二乙酯（DEPC）①

• 特点：
• 相对分子质量162，可溶于水和有机溶剂。②用途及用法：
• 在pH8的水溶液中，杀死细菌和真菌的浓度为0.01%-0.1%(V/V)，pH4.5或以下，杀菌能力更强，是比较理想的培养基灭菌剂。
• 由于它在水中的溶解度小，灭菌时应均匀加到培养基中。③杀菌机理：能杀灭噬菌体，切断噬菌体单链DNA，抑制噬菌体DNA和蛋白质合成，并抑制寄生细胞自溶，是杀灭噬菌体有效的化学药剂。④注意事项：它有腐蚀性，勿接触皮肤。

第82页：2）第二大类

• 抗代谢药物化学结构与微生物必须的代谢物类似例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸
• 3）第三大类：抗生素抗菌谱比较专一，不能同时抑制或杀灭多种微生物，很少用作杀菌剂。

第83页：三、加热灭菌的原理

• 加热灭菌的原理:根据微生物在温度超过最高温度时,细胞中原生质体和酶的基本成分—蛋白质发生不可逆的凝固变性,使微生物在很短时间内死亡这一特性进行的。
• 1.、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；

第84页：（1）微生物对热的抵抗能力

• 营养细胞：60℃，10 min；
• 细菌芽孢：100℃，几分钟甚至几小时
• 嗜热菌的芽孢：120℃，39 min或更长时间（2）致死温度：杀死微生物的极限温度。（3）致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。

第85页：微生物的热致死动力学

• 2、微生物的热致死动力学：对数残留定律
• 一级反应：
• 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即：
• 式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。

第86页：积分边界条件

N0→Nθ；t0=0 式中，θ灭菌时间（s）；N0灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）；Nθ经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。

第87页：由上式可知

要达到彻底灭菌,Nθ=0时,灭菌时间需无限长,这是不切实际的,实际生产采用Nθ=0.001(即1000批次灭菌中只有一次失败);如果以菌体残留数的对数与灭菌时间的实测数在半对数坐标纸上绘图,得残留曲线为一直线;

第88页：热致死反应的速度常

3、热致死反应的速度常数KK是表达微生物耐热性的特征常数，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度愈低，k值愈小；温度度愈高，k值愈大。细菌芽孢在121 ℃时k为1 min–1,是最小的,最耐热,故灭菌以杀死细菌芽孢杆菌为准;

第89页：

第90页：（1）在相同温度下杀灭细菌芽孢所需时间不

杀灭细菌芽孢的温度和时间（1）在相同温度下杀灭细菌芽孢所需时间不同，因为各种细菌芽孢对热的耐受性不同。（2）培养条件不同，耐热性也有差别。

第91页：

第92页：灭菌温度的选择

• 4、灭菌温度的选择
• 式中ΔE为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的ΔE不同。
• ΔE越大，K越小，越耐热

第93页：（1）达到灭菌

培养基灭菌温度的选择（1）达到灭菌目的；（2）使培养基成分破坏减至最少。（3）达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。

第94页：①营养物质破坏反应动力学方程

• 属于一级分解反应动力学
• dc/dt＝－k´c (2-1)
• c----反应物浓度,mol/L;
• t----反应时间,s;
• k´----反应速度常数,1/s;随温度与反应类型而变化

第95页：培养基反应常

• 数k´与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示
• k´=A´·e－E/RT(2-2)
• A´----比例常数;
• E´----反应需要的活化能,J/mol;
• R----气体常数[4.18×1.987J/(mol·K)];
• T----绝对温度,K。

第96页：②菌体死亡动力学方程

• 属于一级动力学反应,同对数残留定律
• dN/dt =－kN (2-3)
• N----菌体残留个数,个;
• t----灭菌时间,s;
• k----反应速度常数,1/s;与灭菌温度、菌种特性有关;
• dN/dt------菌体的瞬时变化速率,个/s;

第97页：其反应常

• 数k与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示:
• k=A·e－E/RT(2-4)
• A----比例常数;
• E----反应需要的活化能,J/mol;
• R----气体常数(4.18×1.987J/(mol·K);
• T----绝对温度,K。

第98页：变换(2-2)(2-4)方程

• 式得直线方程式如下:
• ㏑(k´)=㏑(A´)－E´/RT (2-5)
• ㏑(k)=㏑(A)－E/RT (2-6)
• 以㏑(k) [或㏑(k´)]对1/T作图,可得一直线,直线斜率－E/R(－E´/R)和截距㏑A(㏑A´);
• 破坏酶,维生素活化能E´为80kJ/mol。
• 杀死微生物营养体活化能E为200～270kJ/mol;
• 杀死微生物芽孢活化能E为400kJ/mol以上;

第99页：灭菌温度从T1升高至T2时有

• 菌体反应常数:㏑(k2/k1)=E/R(1/T1－1/T2) (2-7)
• 分解常数:㏑(k´2/k´1)=E´/R(1/T1－1/T2) (2-8)
• 式(2-7)除以式(2-8)得

第100页：由于杀死微生物芽孢活化能E大于营养物

• 质破坏的活化能E´,→㏑(k2/k1)>㏑(k´2/k´1),或k2/k1>k´2/k´
• 即随着温度的升高,灭菌反应常数增加的倍数大于营养物质分解反应常数增加的倍数(Q10表示),也就是说,温度升高,活菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率;
• Q10表示温度每增加10℃时,反应常数与原反应常数之比值,Q´10(分解)为1.5～2,Q10(杀菌)为8～10;
• 要达到相同的灭菌效果,提高灭菌温度可明显缩短灭菌时间,减少培养基因受热时间长而造成的营养成分破坏。

第101页：④结论

采用高温快速灭菌的方法,既可达到灭菌的目的,又可减少营养物质的破坏,通常为121℃,20～30min;4、应用对数残留定律应注意的几个问题;(1)以培养基中原有细菌芽孢数作为灭菌温度和时间的计算依据;(2)规定最终残留菌数为N=10－3;(3)以一般耐热的细菌芽孢k值进行计算。

第102页：四、影响培养基灭菌的其他因素

培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫

第103页：培养基成分

、培养基成分：高浓度有机物包于细胞的周围形成一层薄膜，影响热的传入，灭菌温度升高。以大肠杆菌为例：（1）在水中加热60~65℃便死亡；（2）在10％糖液中，需70℃4~6min（3）在30％糖液中需70℃30min。2、pH值：（1）pH值6.0~8.0，微生物最耐热；（2）pH＜6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。3、培养基中的颗粒：（1）颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。（2）一般含有小于1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。

第104页：五、分批灭菌与连续灭菌

• 一）、分批灭菌的操作过程（实罐灭菌）
• 1）培养基的预热
• 培养基先加热到80－90℃，然后再导入蒸汽升温到120－180℃。
• 目的：1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。
• 方法：先将排气阀打开

第105页：2）培养基灭菌从各路通入蒸汽

（进气口、排料口、取样口），温度升到120－130℃，保温30min

第106页：分批灭菌的注意事项

• 2、分批灭菌的注意事项
• 1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。
• 2）排气量不宜过大，以节约蒸汽
• 3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。
• 4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。

第107页：（二）、连续灭菌

• 1、连续灭菌优点：
• 1）可以采用高温短时灭菌（HTST）；
• 2）发酵罐利用率高；
• 3）蒸汽负荷均衡；
• 4）热效率高；
• 5）可采用自动控制，降低劳动强度；

第108页：连续灭菌流程

2、连续灭菌流程

第109页：

第110页：

第111页：六、培养基灭菌时间的设计与计算

1、分批灭菌(间隙灭菌):灭菌过程分加热、维持、冷却三个阶段,求出升温和降温阶段所需时间,则可求出保温的时间;在升温阶段,培养基温度不断升高,菌死亡速度常数也不断增大,其关系为;若以某耐热杆菌的芽孢为灭菌对象,其A=1.34×1036s－1,E=67930×4.18J/mol

第112页：利用此式可求得不同温度下的灭菌速度常

数;若欲求得升温阶段的平均速度常数,可以用下式求得;式中积分值可利用图解积分法求得;若培养基加热时间θp已知, km值求得,则升温阶段结束时,残留菌数为;在冷却阶段虽然也有灭菌作用,但降温时间较短,在计算时一般不考虑;因此可由下式求得保温阶段所需时间;

第113页：例:有一发酵罐内装40m3培养基

在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每mL有2×105个耐热细菌芽孢;灭菌过程的升温阶段,培养基从100℃上升至121℃,共需15min;121℃时灭菌速度常数为1.8(min－1) ,假设灭菌失败机率为0.001,求升温阶段结束时,培养基中芽孢数和保温所需时间。解:N0=40×106×2×105=8×1012(个),Nθ=0.001(个),k=1.8(min－1),T1=373K,T2=394K,根据求出373K至394K之间若干k值, k－T关系如下

第114页：以k对T作图得图2-7

在k－T曲线图中,若以横坐标2K及纵坐标0.002 s－1组成一小方格,则每小方格的值为2×0.002=0.004s－1;现在用计数法求得k－T曲线以下以及373K～394K之间的范围内小方格共32个,则总面积∫373394kdT之值为32×0.004=0.128(K·s－1)。由此得升温阶段结束时培养基中残留的芽孢数为

第115页：连续灭菌时间的计算:直接用维持阶段进

保温所需时间:2、连续灭菌时间的计算:直接用维持阶段进行灭菌时间的计算,但培养基中含菌数应用每mL培养基的含菌数进行计算:c0、cθ(个/mL)为单位体积培养基灭菌前和灭菌后含菌数;例2-3已知:c0=2×105(个/mL),k=15(min－1)解: cθ=0.001/(40×106)=2.5×10－11(个/mL)

第116页：复习重点

培养基、前体、消毒、灭菌的概念;oBx,DE(术语解释);培养基的种类和用途;影响葡萄糖酸解反应速度常数的因素有哪些;影响葡萄糖复合反应和分解反应的因素有哪些;前体物质的作用;促进剂和抑制剂提高产物产量的原因;灭菌的方法及要求;

第117页：对数残留定律的内容;加热灭菌的原理;

影响培养基灭菌的因素;分批灭菌与连续灭菌的选用;促进剂和抑制剂的作用是什么？湿热灭菌方法的计算。

第118页：六、培养基与设备、管道灭菌条件

1、灭菌锅内灭菌2、种子培养基实罐灭菌3、发酵培养基实罐灭菌4、发酵培养基连续灭菌5、消泡剂灭菌6、补料实罐灭菌7、尿素溶液灭菌

第119页：微生物发酵培养基的碳源、氮源

作业：1、微生物发酵培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质。2、简述发酵工业常用的灭菌方法。3、试画出两种不同的培养基连续灭菌流程图。4、有一株枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，请设计一种优化培养基的方案，使该培养基适合该菌株能产酶能力（淀粉酶）。