05 第五章 培养基的灭菌.ppt

第1页：第五章培养基的灭菌教学内容

本章教学内容：

• 灭菌的原理和方法
• 培养基的灭菌
• 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
• 间歇灭菌
• 连续灭菌

第2页：培养基分类与六大营养要素复习

复习提问：1、培养基如何分类？在发酵生产中常用的是固体还是液体培养基？2、说说培养基的六大营养要素？

• 按用途：增殖培养基、选择培养基、鉴别培养基
• 按状态：固体培养基、液体培养基和半固体培养基
• 按营养物质来源：天然培养基、合成培养基和半合成培养基

第3页：发酵生产中灭菌的原因

问题：在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作（教材 P69）？

1. 杂菌污染会使基质或产物因杂菌消耗而损失，造成生产能力下降
2. 杂菌的代谢产物或染菌后培养液理化性质的改变，使产物提取分离困难，收率降低或质量下降
3. 杂菌大量繁殖会改变反应介质的 pH 值，使生物反应发生异常变化
4. 杂菌可能分解产物，从而使生产过程失败
5. 发生噬菌体污染时微生物细胞被裂解，使生产失败

第4页：消毒与灭菌的区别

为防止杂菌污染，需要灭菌的对象包括：培养基、发酵设备、空气、菌种制作相关的器具与环境。

消毒

用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。如巴氏消毒法将物料加热至 60 ℃ 维持 30 min，用于牛奶、啤酒和酿酒原汁等不耐高温物料。

灭菌

用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌可达到消毒的目的。

第5页：

本页源文件未提取到文字内容，仅有图片。建议对照原课件图片补充本页要点说明，并按前后页顺序核对本页在章节中的位置。

第6页：灭菌方法与适用对象连线

灭菌方法与适用对象的对应：

• 接种针、试管口 → 火焰灭菌法
• 无菌室、接种箱 → 射线灭菌法、化学试剂灭菌法
• 培养基的灭菌 → 湿热灭菌法
• 环境空气、皮肤表面 → 化学试剂灭菌法、空气过滤除菌法

连线比较对象包括营养细胞、芽孢、病毒或孢子，以及各种微生物对热的抵抗能力大小。

第7页：火焰灭菌法与湿热灭菌原理

火焰灭菌法

适用范围为接种针、玻璃棒、三角瓶口等，直接在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

湿热灭菌原理

蒸汽具有很强的穿透能力，冷凝时放出大量冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。

灭菌条件

121 ℃、30 min。

不利方面：同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质。因此工业培养中除尽可能杀死杂菌外，还要尽可能减少培养基营养成分的损失。

第8页：衡量热灭菌的指标与相对热阻

热死时间

在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。

致死温度

杀死微生物的极限温度。

致死时间

在此温度下杀死全部微生物所需要的时间。

热阻

对热的抵抗力，指微生物在特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。

相对热阻

几种微生物对热的相对抵抗能力，即某一微生物的致死时间与另一微生物在相同条件下致死时间的比值。

第9页：微生物的死亡曲线

图 5-2、图 5-3 分别为大肠杆菌营养细胞和 FS7954 芽孢杆菌的芽孢在不同温度下的死亡曲线：以时间 t（min）为横坐标、存活率 N/N₀ 为纵坐标（对数刻度），温度越高曲线下降越陡。

问题：说说芽孢或孢子的热阻比营养细胞的热阻大的原因——芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量与热阻增加有关，且芽孢中蛋白质含水量较营养细胞低（特别是游离水分少），也是耐热性强的原因。

第10页：微生物的对数残留定律

1、微生物的死亡速率：对数残留定律——微生物受热死亡主要是高温使体内重要蛋白质（如酶）凝固、变性而致死，微生物受热丧失活力但物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。

灭菌过程中活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。

工厂里蒸汽容易获得、操作条件方便控制，湿热灭菌是一种简单、价廉而有效的灭菌方法。加热受热时间与灭菌程度和营养成分破坏都有关系，恰当掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。

第11页：灭菌基本公式与速度常数

微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比，即

dN/dt = −K·N

积分得：t = (1/K)·ln(N₀/N_t)

式中：N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s^-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，其大小与微生物种类和加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率；N₀—开始灭菌（t=0）时原有活菌数；N_t—经时间 t 后残存的活菌数。

第12页：灭菌速度常数与彻底灭菌的极限

上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数 K 是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样温度下 K 值不同，K 值愈小则愈耐热。

例题：在 121 ℃ 时，枯草杆菌 FS5230 的 K 为 0.047 s^-1，梭状芽孢杆菌 PA3679 的 K 值为 0.03 s^-1，后者 K 更小，因此梭状芽孢杆菌 PA3679 更耐热。

由微生物对数死亡规律可知，若要达到彻底灭菌（残留活微生物数为 0），所需时间应为无限长，这在实际中是不可能的。

第13页：非对数死亡定律与工程取值

1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈现非对数死亡定律（如图 5-3 所示）。

2）工程上进行灭菌设计时，常认为 N/N₀ = 0.001，即在 1000 次灭菌中允许有一次失败。

课件同时给出大肠杆菌营养细胞与嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下（如 105—124 ℃）的死亡曲线对比。

第14页：灭菌温度与灭菌速度常数的关系

微生物受热死亡属单分子反应，灭菌速率常数 K 与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：

K = A·e^−ΔE/RT

式中：A—频率常数（阿累尼乌斯常数，s^-1）；R—气体常数，8.314 J/(mol·K)；T—绝对温度（K）；ΔE—微生物死亡活化能（J/mol）。

加热时微生物固然会被杀死，但培养基中的有用成分也会遭到破坏：在高压加热情况下，培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏，如在 121 ℃ 仅 20 min，就有 59% 的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏，蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。

第15页：培养基成分分解速率与温度的关系

灭菌时培养基成分分解速率常数 K′ 与温度之间的关系同样可用阿累尼乌斯公式表示：

K′ = A′·e^−ΔE′/RT

式中：K′—培养基内易被破坏成分的分解速率常数；A′—频率常数（s^-1）；R—气体常数，8.314 J/(mol·K)；T—绝对温度（K）；ΔE′—培养基成分分解所需活化能（J/mol）。

当培养基成分从 T₁ 上升到 T₂ 时，微生物的死亡速率与培养基的分解速率呈不同的增长倍数关系，K 值的大小与微生物种类和加热温度有关。

第16页：高温短时灭菌的理论依据

通过实验测定可知：灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值，因此随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分破坏速率的增加倍数。

结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分破坏速率的增加。

第17页：灭菌温度时间与营养成分破坏量

热灭菌过程中同时发生微生物死亡和培养基破坏两种过程，两者速度都随温度升高而加速，但微生物死亡速率随温度升高更为显著，因此可选择合适的灭菌温度和时间调和矛盾。

由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。

第18页：高温短时灭菌的选择原则

结论2：灭菌时选择较高的温度、较短的时间，既可达到需要的灭菌程度，又可减少营养物质的损失。

问题：要杀死 99.99% 的细菌芽孢，可采取 118 ℃ 灭菌 15 min 或 128 ℃ 灭菌 5 min，哪一种方法好？

答：从理论研究和生产实践都可证明，灭菌过程中同时发生微生物死亡和培养基破坏两种过程，两者速度都随温度升高而加速，但微生物死亡速率随温度升高更为显著。因此对同一灭菌效果，应选择较高温度、较短时间。

下面阅读教材 P78—81，讨论影响灭菌的因素。

第19页：影响灭菌的因素

简答：影响灭菌的因素有哪些？

• 培养基成分
• 培养基的物理状态
• 培养基的 pH 值
• 培养基中的微生物数量
• 微生物细胞中水含量
• 微生物细胞菌龄
• 微生物的耐热性
• 空气排除情况、搅拌、泡沫

问题：为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，灭菌温度就得相应高些？

第20页：灭菌影响因素的判断题

判断与简答：

• 为什么说液体培养基比固体培养基更易灭菌？
• 培养基的 pH 值越低，灭菌所需的时间就愈短
• 实际生产中不宜采用严重霉腐的水质，因其微生物数量多，影响灭菌效果
• 微生物含水量越多，灭菌时间就得越长
• 年轻细胞比年老细胞更易杀死
• 灭菌的彻底与否应以杀死细菌芽孢为准，而非仅杀死营养细胞
• 灭菌过程中充分搅拌更有利于灭菌
• 灭菌过程中培养基发生泡沫对灭菌很不利

第21页：罐内空气排除与灭菌温度

问题：在灭菌过程中，为什么要排除罐内空气？

蒸汽灭菌过程中温度的控制通过控制罐内蒸汽压力实现。若罐内空气排除不完全，压力表显示的压力就不单是蒸汽压力，还包括空气分压，此时罐内实际温度低于压力表显示压力所对应的温度，以致灭菌温度不够、灭菌不彻底。

说明：源文件本页数据为连续文本，第二表按空气排除程度与罐内实际温度的对应关系整理，建议对照教材表 5-12 原表复核。

第22页：间歇灭菌的定义与三阶段

间歇灭菌（实罐灭菌）

将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭菌的过程，为常用方法。

发酵罐灭菌过程包括升温、保温和冷却三个阶段，各阶段对灭菌的贡献约为 20%、75%、5%（图 5-7 为培养基间歇灭菌过程中的温度变化，升温至 121 ℃ 保温后冷却）。

若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作在保温阶段被杀灭，可简单地利用式 5-3 粗略求得灭菌所需时间。

第23页：实罐灭菌时间的计算实例

例题：有一发酵罐内装 40 m³ 培养基，在 121 ℃ 下进行实罐灭菌。原污染程度为每 1 mL 有 2×10⁵ 个耐热细菌芽孢，121 ℃ 时灭菌速度常数为 1.8 min^-1。求灭菌失败机率为 0.001 时所需要的灭菌时间。

解：N₀ = 40×10⁶ × 2×10⁵ = 8×10¹²（个），N_t = 0.001（个），K = 1.8 min^-1。

说明：源文件本页未给出计算结果，按对数残留定律 t = (1/K)·ln(N₀/N_t) 推算，保温时间约 20.3 min，供参考。

实际上培养基在升温阶段就会杀灭部分菌（加热到 100 ℃ 以上时作用显著），因此保温灭菌时间比上述计算值要短；降温阶段也有杀菌作用，但时间短，一般不考虑。

第24页：蒸汽不足时的间歇灭菌对策

实际生产中若所供蒸汽不足、温度不够高，可适当延长灭菌时间，甚至可用 100 ℃ 蒸煮达到彻底灭菌。

实例：做固体曲而没有高温蒸汽时，可将原料用 100 ℃ 蒸汽蒸 30 min，杀死其中的营养细胞，但孢子与细菌芽孢未被杀死；将蒸过的原料置于室温下过夜，未被杀死的孢子便发芽生长、芽孢发育成营养细胞，再蒸 30 min 便可杀死。如此连续反复进行 2—3 次，亦可达到彻底灭菌的目的。

灭菌过程中加热和保温阶段的灭菌作用是主要的，冷却阶段作用很小可忽略。此外应避免长时间加热，否则不仅破坏营养物质，还可能引起培养液中某些有害物质的生成。

第25页：间歇灭菌的操作步骤

3、间歇灭菌的操作：在配制罐中配好培养基后通过专用管道输入发酵罐等培养设备，然后开始灭菌。

• 灭菌前通常先将发酵罐的分空气过滤器灭菌并用空气吹干
• 放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，经空气管向培养基通入蒸汽加热，也可在夹套内通蒸汽间接加热
• 温度升到 70 ℃ 左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热
• 温度升至 120 ℃、罐压为 1×10⁵ Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门排汽；培养基液面下的进口管道都应通入蒸汽，液面以上管道排放蒸汽，以不留死角
• 保温结束后依次关闭各阀门，待罐内压力低于空气压力后通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温至所需温度

间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少、设备要求简单、对蒸汽要求较低且灭菌效果可靠，是中小型生产工厂常用的培养基灭菌方法。

第26页：连续灭菌的定义与基本设备

连续灭菌

将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。

连续灭菌的基本设备（流程：配料罐 → 泵 → 加热塔 → 维持罐 → 冷却管 → 发酵罐）：

1. 配料预热罐：将料液预热到 60—70 ℃，避免与蒸汽温差过大产生水汽撞击声
2. 连消塔：使高温蒸汽与料液迅速接触混合，料液温度很快升高到灭菌温度（126—132 ℃）
3. 维持罐：使料液在灭菌温度下保持 5—7 min，以达到灭菌目的
4. 冷却管：从维持罐出来的料液经冷却排管（冷水喷淋）冷却到 40—50 ℃，输送到预先灭菌过的罐内

第27页：喷射加热与薄板换热器连续灭菌流程

喷射加热连续灭菌流程

采用蒸汽喷射器使培养液与高温蒸汽直接接触，短时间内急速升温至预定灭菌温度（约 140 ℃），维持一段时间后经膨胀阀进入真空冷却器急速冷却。特点是受热时间短、营养物质损失不严重，物料先进先出，避免过热或灭菌不彻底。

薄板换热器连续灭菌流程

以薄板换热器作为加热和冷却器：蒸汽在加热段升温，经维持段保温后，在冷却段冷却，使预热、加热灭菌及冷却在同一设备内完成。加热和冷却时间比喷射加热流程长些，但预热过程同时起到冷却灭菌后培养基的作用，节约蒸汽和冷却水用量。

流程温度节点：进料 35 ℃ → 100 ℃ → 120 ℃（维持罐）→ 147 ℃ 蒸汽、120 ℃ → 55 ℃ → 出料 35 ℃。

第28页：间歇灭菌与连续灭菌的比较

六、间歇灭菌与连续灭菌的比较：

加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先行灭菌。无论在理论上或实践上，与间歇灭菌相比连续灭菌的优点都十分明显，因此越来越多地被用于培养基的灭菌。

第29页：第五章培养基的灭菌结束页

第五章培养基的灭菌内容结束。本章重点为湿热灭菌原理、对数残留定律、高温短时灭菌原则与间歇、连续灭菌的比较。