第1页：第二章工业微生物基础教学内容
本章教学内容：
- 微生物的特点
- 常见的工业微生物
- 工业微生物菌种的分离和选育
- 工业微生物菌种的改良
- 工业微生物菌种的保藏
- 工业微生物菌种的扩大培养
第2页：微生物的特点与微生物的概念
一、微生物的特点：
- 种类多，分布广
- 高面积—体积比，代谢能力强
- 生长迅速，繁殖快
- 适应性强，容易培养
- 易变性
- 微生物
- 指个体微小、结构简单，必须借助显微镜才能看清外形的一群微小生物。广义包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。
- 发酵工业常见类群
- 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌，以及危害细菌与放线菌生长的噬菌体。
第3页：细菌的芽孢与放线菌
- 细菌与芽孢
- 某些细菌在生长发育后期于细胞内形成圆形或椭圆形的抗逆性休眠体——芽孢，抗热、抗辐射、抗化学物质。如热解糖梭菌的营养细胞在 50 ℃ 下短时间即被杀死，而其芽孢在 132 ℃ 下经 4 分多钟才能杀死其中的 50%。
- 放线菌
- 属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。
细菌属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，分革兰氏阳性菌和阴性菌；发酵专业中常用的是杆菌，易形成芽孢。
第4页：霉菌与酵母菌
- 霉菌
- 属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副产品发霉变质。
- 酵母菌
- 属真核单细胞生物，主要生长在偏酸、含糖量较高的环境中，在酒精、饮料等生产中有重要用途。
第5页：噬菌体及其对发酵的危害
- 噬菌体
- 是一种感染原核生物的病毒，分烈性噬菌体和温和噬菌体，能严重危害发酵生产。
课件另附噬菌体侵染细菌过程的演示，以及工业上常用微生物及用途的列表链接。
思考：在发酵生产中，哪些是工业上常用的微生物？
第6页：从自然界分离新菌种的步骤
四、工业微生物菌种的分离（教材 P12）：从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤。
- 采样（确定地点与方法）
- 增殖培养（目的性富集）
- 纯种分离
- 性能测定
分离得到的菌种再进入育种环节。
第7页：菌种选育的目的与基本方法
- 菌种选育
- 按照生产的要求，根据微生物遗传和变异理论，用人工方法造成菌种变异，再经过筛选达到菌种选育的目的。
- 选育的目的
- 改善菌种特性，提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用。
- 基本方法
- 自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技术和体外重组 DNA 技术（基因工程）等。
野生型菌株普遍存在产量低、副产物多、生产周期长的缺点，需经选育改造。
第8页：诱变育种与代谢控制育种
- 诱变育种
- 一般采用物理、化学诱变因素使微生物 DNA 的碱基排列发生变化，使排列错误的 DNA 模板形成异常遗传信息，造成某些蛋白结构变异，使细胞功能发生改变（较传统的方法，教材 P16）。
- 代谢控制育种
- 主要有两个方面：一是改变代谢通路的育种，二是改变代谢自动调节系统的育种。
课件同时给出原生质体融合基本过程示意图，育种方法在微生物学中已有详细介绍。
第9页：原生质体融合基本过程
原生质体融合基本过程（教材 P18—P19）：
- 营养细胞经细胞壁溶解去除细胞壁
- 形成原生质体
- 两原生质体融合
- 形成融合细胞
- 细胞壁再生，恢复为完整细胞
该技术是工业微生物菌种改良的重要手段，可实现远缘菌株的遗传物质重组。
第10页：工业微生物菌种的保藏
- 菌种保藏的目的
- 使菌种的生命得以延续并保持原有的生物学特性：基础研究中保证实验结果可重复；生产菌保持高产、高抗性；重组菌保持遗传特性稳定。
- 基本原理
- 根据微生物生理、生化特点，人工创造低温、干燥、缺氧条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，尽可能少发生突变以保持纯种。
- 具体方法
- 斜面保藏法和穿刺保藏法、干燥保藏法、悬液保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、低温保藏法。
第11页：表面培养与固体培养的概念
1、微生物的培养方法
- 表面培养
- 将纯种微生物接种在固体或液体培养基表面，在恒温条件下静置培养。实验室的固体斜面培养、固体平板培养以及液面形成膜状物的液体培养均属表面培养。特点是既能接触空气吸收氧气又能接触培养基吸收营养，但生长缓慢、占用面积大、容易染菌，大规模生产中很少采用。
- 固体培养
- 将纯种微生物接种在固体培养基上，是介于表面培养和深层培养之间的培养方式。
第12页：固体培养基的特点与优缺点
工业上常用大米、麸皮、米糠、谷壳、木屑等为基本原料，适当补充其他营养成分和水分，经灭菌后制成微生物培养基。
- 固体培养基疏松、内部充满空气，既可静置培养又可通风培养
- 优点：设备简单、投资少，适合小规模生产
- 缺点：占地面积大、劳动强度高、产品质量不太稳定
第13页：液体深层培养的特点
液体深层培养又叫液体通风培养：菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部，整个过程在专门的发酵罐中进行。
优点：可根据微生物对碳源、氮源、生长因子等营养物质及温度、pH 值、需氧量等条件的不同需要，合理配制培养基，随时补加营养物质并调节温度、pH 值和通风量，把生长与代谢控制在最佳状态。
第14页：微生物扩大培养的目的与任务
- 菌种扩大培养的目的
- 为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。
- 种子扩大培养的任务
- 不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛、接种数量足够的培养物。
种子扩大培养的过程：斜面菌种 → 一级种子培养 → 二级种子培养 → 发酵罐。
接种量大则发酵时间短，接入较多成熟菌体可缩短发酵时间、提高发酵罐利用率并减少染菌机会。
第15页：种子扩大培养流程与种子罐级数
种子扩大培养流程（教材 P25 图 2-2）：
- 实验室种子制备阶段（一级种子培养）：砂土孢子、冷冻干燥孢子 → 斜面孢子 → 摇瓶液体培养 / 茄子瓶斜面培养 / 固体培养基培养
- 生产车间种子制备阶段（二级、三级种子培养）：一级种子罐 → 二级种子罐 → 发酵罐
- 种子罐级数
- 指制备种子需逐级扩大培养的次数，根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度和发酵罐容积而定。谷氨酸生产于 32 ℃ 培养 7—10 h、菌浓达 108—109 个/mL 即可接入发酵罐，为一级种子罐扩大培养（二级发酵）；青霉素菌种在一级种子罐 27 ℃ 培养 40 h 后再移入二级种子罐 27 ℃ 培养 10—24 h，为二级种子罐扩大培养（三级发酵）。一般 50 m3 发酵罐采用三级发酵。
第16页：接种龄与接种量的选择
问题1：种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，减少多次移种带来的染菌机会；但也要尽量延长发酵罐产物积累时间、缩短种子发芽生长占用的非生产时间，以提高发酵罐生产率。
- 接种龄
- 指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期、培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。种子过年轻会使前期生长缓慢、周期延长，过老则生产能力下降、菌丝过早自溶。
- 接种量
- 指移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例。大多数抗生素发酵的最适接种量为 7%—15%，棒状杆菌谷氨酸发酵只需 1%。接种量过大会使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物合成。
第17页：菌种退化的结果与原因
七、菌种退化及其防治
- 菌种退化的结果
- 使所需产物的产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境性能减弱。退化是由个别菌体细胞衰退逐渐导致整个菌株退化的量变到质变的遗传变异过程，不同于环境引起的暂时变化。
- 退化的原因
- 细胞内 DNA 结构发生变化，可归结为内因（自身变化）和外因（环境影响）两方面。菌种连续传代是退化的直接原因，培养物常处于旺盛生长状态且每次传代营养与环境条件都在变化。
第18页：菌种自身突变与回复突变
菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身变化的主要原因。微生物细胞在每一世代中的突变机率一般为 10-8—10-9，保藏在 0—4 ℃ 时机率更小，但仍不能排除退化的可能。
- 回复突变
- 指变异菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除、代谢途径发生变化，从而恢复原有特性，表现出育种中已获得的优良性状的退化，俗称“返祖”。
防治原则：菌种退化会引起产量急剧下降，一旦发生必须及时采取预防和防治措施，并对退化性状及时分离纯化，保持生产菌种的优良特性。
第19页：退化菌种的复壮措施
- 菌种的复壮
- 指淘汰已退化菌种中的衰退个体，使其恢复原来优良的特性。
具体措施：
- A、配合一定培养条件，对退化菌株进行单菌落或单细胞分离，淘汰退化个体、纯化菌种
- B、将芽孢杆菌悬液加热至 90 ℃ 处理数分钟，杀灭已退化菌体、保留芽孢，再将芽孢或孢子传代
- C、提供特殊培养条件，使环境利于优良性状菌株生长而不利于退化菌株生长
- D、将分离得到的初筛菌株先保藏，再复筛考察，选出稳定性较好的菌种
- E、同时应用上述两种或两种以上方法，效果更好
第20页：提供良好的环境条件防止退化
2）提供良好的环境条件防止菌种退化：
- A、进行合理的传代
- B、采用优良的保藏方法
- C、定期纯化菌种
常用保藏方法包括：斜面冰箱保藏法、石蜡油封藏法、砂土保藏法、冷冻干燥保藏法。
