12 第十二章 植物细胞的大规模培养技术.ppt

第1页：第十二章植物细胞大规模培养教学内容

本章教学内容：

• 植物细胞培养基
• 植物细胞培养方法
• 植物细胞的大规模培养技术
• 影响植物细胞培养的因素
• 植物细胞培养反应器

第2页：植物细胞培养的背景与意义

植物中含有数量极为可观的次生代谢物质。据保守估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过 2 万种，而且还在以每年新发现 1600 种的速度递增。李时珍编纂的巨著《本草纲目》中所开列的 1892 种药物绝大多数是植物，目前仍约 25% 的法定药品来自植物。

然而植物生长缓慢、自然灾害频繁，即使大规模人工栽培仍不能从根本上满足需求。因此早在 1956 年，Routier 和 Nickell 就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。

第3页：植物细胞培养的发展与我国的研究

Reinhard 等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱（harmine）。紧接着 Kaul 等（1969）、Furrya 等（1972）和 Teuscher 等（1973）分别培养植物细胞获取了薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。

• 目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达 2 万升（20 吨）
• 我国在“八五”“九五”和“863 计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到 60 mg/L 的世界先进水平

植物细胞培养

指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。

第4页：紫草宁的两种生产方式比较

目前植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模培养通常在培养瓶中完成，大规模培养可在发酵罐中进行。

思考：请列举 3 至 5 种由大规模培养植物细胞获得的有经济价值的产物——紫草宁、抗肿瘤药物紫杉醇、薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精等。

第5页：植物细胞培养基的组成

与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但培养细胞、组织和器官的培养基需满足各自的特殊要求。

植物细胞培养基通常包括：无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂等。

• 无机盐类：微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等
• 维生素：植物细胞生长都需要硫胺素，可加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等
• 碳源和能源、原生质体培养所需的大多数必需维生素（教材 P225）

第6页：植物生长激素、有机氮源与复合物质

植物生长激素

大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素，包括植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸四大类。

有机氮源

通常采用蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等（教材 P225）。

有机酸

加入丙酮酸，或柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羧酸循环中间产物，可保证植物细胞在以铵盐为单一氮源的培养基上生长，并使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到 10 mmol/L，还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。

复合物质

酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等通常可作为细胞的生长剂。

目前应用最广的基础培养基主要有 MS、B5、E1 以及 N6 培养基（表 12-2）。

第7页：植物细胞培养基的制备

2、植物细胞培养基的制备：

• 无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生长激素应采用最高纯度级的试剂，有些生长激素使用前需重结晶提纯
• 难溶于水的生长激素可先溶于 2—5 mL 酒精中，酒精—水溶液用吸附法脱色，再慢慢加入蒸馏水、稍微加热后稀释至所需体积
• 配制用水应严格采用蒸馏水或高纯度去离子水，以玻璃器皿制备的蒸馏水最好
• pH 值用 0.5 mol/L 的 HCl 或 0.2 mol/L 的 NaOH 调节；固体培养基须加入琼脂
• 配制好的培养基装入三角瓶或试管中，121 ℃ 灭菌 20 min
• L-谷氨酰胺、植物生长激素等热敏性化合物应采用过滤法灭菌后无菌加入

培养基常配成使用浓度 10 或 100 倍的母液，于 10 ℃ 以下冰箱保存；含有机物或激素的母液最好不超过十天。CaCl₂、KI、EDTA 的钠盐或亚铁盐需单独配制保存，使用时再稀释混合。

第8页：原生质体培养与单倍体培养

原生质体培养

植物的体细胞（二倍体细胞）经纤维素酶处理去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最后长成植株。实际过程中可用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，获得体细胞杂交植株。

单倍体细胞培养

主要用花药在人工培养基上培养，可从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；也可通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。

第9页：固体、液体、悬浮与固定化培养

固体培养

在微生物培养基础上发展而来，凝固剂几乎都使用琼脂，浓度一般为 6%—10%。原生质体固体培养需混入培养基内嵌合培养，或在固体—液体之间双相培养。

液体培养

分为静止培养和振荡培养两类：静止培养不需设备，适合某些原生质体培养；振荡培养需摇床或转床使培养物与培养基充分混合以利气体交换。

悬浮培养

使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法，需提供易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，以获得比较纯一的单细胞。

固定化培养

在微生物和酶的固定化培养基础上发展而来，应用最广泛的、能保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。

第10页：大规模悬浮培养与封闭系统

三、植物细胞的大规模培养技术：目前主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。

1953 年 Muir 成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。继之 Tulecke 和 Nickell（1959）推出 20 L 的植物细胞封闭式悬浮培养系统：经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌，当营养耗尽、细胞数目不再增加且次生物质达一定含量时收获细胞、提取产物。他们用此系统成功培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。该系统结构简单、易于操作，但生产效率不够高，次生物质累积量也较少。

第11页：悬浮培养中植物细胞的特性

由于植物细胞有其自身特性，尽管人们已在各种微生物反应器中成功进行植物细胞培养，但植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养是不同的，尤其是培养液的流变特性。

思考：

1. 在悬浮培养时，植物细胞是以单一细胞存在还是以细胞团形式存在？
2. 植物细胞以细胞团形式存在的原因？
3. 常用粘度描述植物细胞培养液的流变学特征，培养液粘度的变化主要由什么引起，而不是分泌物引起？

第12页：氧传递、CO2与泡沫问题

氧对植物细胞的生长很重要，但 CO₂ 的含量水平对细胞生长同样相当重要。研究发现植物细胞能非光合地固定一定浓度的 CO₂，如在空气中混以 2%—4% 的 CO₂ 能够消除高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此，对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时，CO₂ 和氧气的浓度只有达到某一平衡时才会很好地生长，所以有时需要通入一定量的 CO₂ 等气体。

思考：4、说说过高的通气速率对植物细胞生长不利的原因？5、为什么有时要通入一定量的 CO₂ 气体？6、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？

第13页：悬浮细胞的生长曲线

悬浮培养时细胞的生长曲线如图 12-1 所示，细胞数量随时间的变化呈现 S 形：接种后最初细胞很少分裂，经历延滞期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是增殖减慢期和停止生长的静止期。整个周期长短因植物种类和起始培养细胞密度而异，一般在静止期或静止期前后进行继代培养。

悬浮培养的三个基本优点：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；带走有害代谢产物，避免局部浓度过高；保证氧的充分供给，使生长条件比固体培养有很大改善。

第14页：细胞团和愈伤组织的再形成与植株再生

悬浮培养的单个细胞在 3—5 d 内即可见细胞分裂，经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后，将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，三星期后可分化出试管苗。

第15页：紫杉醇与植物细胞培养的产物

紫杉醇是近年发现的重要抗癌药物，能有效治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科癌症。但由于紫杉醇是从珍稀植物紫杉提取的，如何得到充足的药物一直是医学和环境学家争论的问题——其生产只能通过大量砍伐这种珍稀植物，显然将对环境产生不良影响，所以目前科学家们正在开展紫杉醇细胞培养法进行生产和研究。

我国在“八五”“九五”和“863 计划”中连续拨款资助工业化培养和生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到 60 mg/L 的世界先进水平。

复习：请列举 3 至 5 种由大规模培养植物细胞获得的有经济价值的产物。

第16页：植物细胞与原生质体的固定化培养

2、植物细胞或原生质体的固定化培养：由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较高的机械稳定性、产率以及更长的稳定（生产）期等许多优点，因此通常采用固定化来进行植物细胞的培养，包括植物细胞和原生质体的固定化培养。

细胞固定化

将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面，其前提是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。

第17页：固定化促进次生物质合成的原因

针对悬浮培养的缺点，Brodelius 等（1979）首次报道用海藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。

• 细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成
• 固定化后便于对环境因子的参数进行调控
• 有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键

思考：为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生物质的生成？

第18页：海藻酸钙固定植物细胞的技术路线

褐藻（海藻）钙固定植物细胞的技术路线：

1. 大量培养植物细胞
2. 配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌
3. 通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液中混合
4. 倒入塑料注射器中，慢慢滴入含有 CaCl₂ 的培养基中，不断搅拌使之形成球形颗粒
5. 过滤收集颗粒，用含 CaCl₂ 的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中培养

第19页：大规模植物细胞固定化装置

大规模植物细胞的固定化原则上可根据上述方法进行，但不能再用塑料注射器，而需要采用图 12-2 所示的大规模细胞固定化装置：装置含喷嘴、无菌空气入口、空气出口与盖子，海藻酸钠＋细胞悬浮液经喷嘴滴入含 CaCl₂ 的培养基中形成固定化颗粒。

第20页：卡拉胶、琼脂糖与原生质体固定化

其他固定化方法包括卡拉胶固定化（P230）、琼脂糖固定化（P231）和琼脂固定化（P231）。由于原生质体比完整的细胞更脆弱，只能采用最温和的固定化方法，通常也用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。

思考：1、用卡拉胶固定化植物细胞的方法有哪些？2、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？3、植物细胞固定的四种方法中，哪些需要其他离子来保持胶的稳定性，分别用什么离子？

第21页：植物细胞培养的成就与展望

人类迄今通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下 50 多个大类，其中已有 30 多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。在已研究过的 200 多种植物细胞培养物中，已发现可产生 300 余种对人类有用的成分，其中不乏临床上广为应用的重要药物。

利用培养植物细胞工厂化生产生物天然次级代谢产物的前景已经十分清楚地展现出来。深入发掘我国特有的巨大中草药宝库，结合现代细胞培养技术，我国植物细胞次生物质的研制与生产一定会硕果累累。

第22页：植物细胞的培养方式

3、植物细胞培养方式主要有间歇培养、连续培养和固定化培养等多种。间歇培养包括：

• 两级或多级间歇培养
• 流加间歇培养

第23页：固定化细胞与连续培养

连续培养包括单级连续培养、多级连续培养和回流式连续培养。

固定化细胞培养具有许多潜在的优越性，如能提高生产能力、保护细胞、换液方便、能除去有毒或抑制性代谢物等。选用固定化细胞培养应具备两个条件：

1. 目的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改变 pH 值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培养基中
2. 要求产物的形成在细胞生长之后

第24页：产物合成的动力学类型与遗传特性

四、影响植物细胞培养的因素：植物细胞生长和产物合成动力学可分为三种类型：

生长偶联型

产物的合成与细胞的生长呈正比。

中间型

产物仅在细胞生长下降时才能合成，细胞处于指数生长期时次级产物含量下降，但细胞生长停止时产物合成也停止。

非生长偶联型

产物只有在细胞生长停止时才能合成。

事实上由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少完全符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，各细胞所处的生理阶段不同，也许是群体中部分细胞代谢的结果，此外不同的环境条件对产物动力学也有很大影响。

第25页：影响植物细胞培养的环境条件

2、培养的环境条件包括：pH 值、温度、营养成分、光、搅拌和通气、前体和调节因子。

思考：

1. 在进行植物细胞的培养时，为什么先弄清楚产物的合成部位？
2. 影响植物细胞培养的环境条件有哪些？
3. 植物细胞培养的温度和 pH 值一般为多少？
4. 机械搅拌造成的剪切为何对植物细胞影响较大？
5. 生长调节剂有何作用？加入外源前体物质有何作用？
6. 植物细胞大规模培养可划分为哪两个阶段？

第26页：植物细胞培养的两阶段策略

影响植物细胞培养物生物量增长和次生代谢物积累的因素错综复杂，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，需要在培养过程中不断加以平衡和研究。同时不同的植物有机体有其本身的特殊性，对一种植物或一种次生代谢物合适的条件不一定适用于其他细胞。

目前，对植物细胞大量培养一般分成两个阶段：

1. 第一阶段：利用生长培养基，尽可能快地使细胞的生物量得到增长
2. 第二阶段：通过生产培养基来诱发和保持次生代谢作用

第27页：植物细胞培养反应器的类型

五、植物细胞培养反应器主要有：

1. 机械式搅拌生物反应器（P234）
2. 鼓泡塔与气升式生物反应器（P234）
3. 填充床生物反应器
4. 流化床生物反应器
5. 膜式生物反应器

第28页：填充床生物反应器

填充床生物反应器（图 12-4a）：细胞可以位于支撑物表面，也可包埋于支撑物之中，培养液流经支撑物颗粒不断被细胞所利用，已被用于植物细胞的培养。

• 优点：单位体积固定细胞量大
• 缺点：混合效果低，对必要的氧传递、pH 与温度控制和气体产物排除造成困难；大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除困难，限制了其应用于不要求细胞活性的生物转化

第29页：流化床生物反应器

流化床生物反应器（图 12-4b）：利用流体的能量来悬浮颗粒。由于使颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大小成正比，通常采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的主要优点。

最大缺点：剪切和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。

第30页：膜生物反应器

膜生物反应器（图 12-5）：植物细胞培养过程中主要采用中空纤维和螺线式卷绕反应器。

• 优点：可以重复使用，尽管投资较大仍较经济
• 由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层

图中 a 为中空纤维反应器，b 为螺线式卷绕反应器，均由营养物入口、营养物出口与固定化细胞层构成。

第31页：第十二章植物细胞大规模培养结束页

第十二章植物细胞大规模培养内容结束。本章重点为植物细胞培养基、悬浮与固定化培养技术、影响因素与各类反应器。