04 第四章 动物细胞培养制药工艺.pptx

第1页：第四章动物细

第四章动物细

第四章动物细胞培养制药工艺1.制药动物细胞2.动物细胞的生产特征3.动物细胞培养基制备4.动物细胞培养技术5.重组人红细胞生成素的生产工艺

第2页：岛动物细胞的结构

岛动物细胞的结构与功能岛制药动物细胞的种类岛生产用细胞系4.1制药动物细胞细胞培养制药工艺细胞系

第3页：4.1.1动物细胞的结构与功能

4.1.1动物细胞的结构与功能1.形态特征岛细胞膜岛细胞质岛细胞核岛没有细胞壁岛亚细胞器细胞培养制药工艺细胞系

第4页：2、动物细胞培养的代谢特征

2、动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。葡萄糖限制:通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之亦然。葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为TCA循环，彻底氧化产生CO2和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成4、5、7碳糖和NADPH。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性

第5页：Gln代谢

Gln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。Gln能量:Glu转化为α-酮戊二酸，进入TCA循环。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累

第6页：3、蛋白质糖基化与分泌表达蛋白质合成

3、蛋白质糖基化与分泌表达蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质网腔内和高尔基体，加工修饰。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放到胞外，完成了蛋白质的分泌表达

第7页：4.1.2制药动物细胞的种类

4.1.2制药动物细胞的种类目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系细胞培养制药工艺细胞系

第8页：细胞系分类来源

细胞系分类来源：原代细胞，传代细胞。寿命：有限细胞系，无限细胞系。染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞系

第9页：1.原代细胞

1.原代细胞primarycell概念：从动物体内直接分离得到的细胞。特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似应用：药物检测实验，药理研究。生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞

第10页：2.传代细胞

2.传代细胞passagecell概念：原代细胞转接后培养的细胞。特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型。二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯化后，获得具一定特征的细胞系。。药品生产：WI－38、MRC－5、2BS等

第11页：3.有限细胞系

3.有限细胞系Finitecellline概念:生长和寿命有限的细胞系。二倍体细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡。寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数为50－60代。胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代

第12页：4.无限细胞系

4.无限细胞系Infinitecellline概念：生长和寿命不受限制的细胞系，能连续传代培养。连续细胞系：Continuouscellline永久性细胞系：Immortalcellline特点：细胞无限分裂,不具有接触抑制现象，不出现异常染色体。理想的药物生产细胞系.细胞培养制药工艺细胞系

第13页：5.工程细胞系概念

5.工程细胞系概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组

第14页：6.转化细胞系概念

6.转化细胞系概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低，适于大规模工业化生产

第15页：4.1.3生产用细胞系

4.1.3生产用细胞系1.人源细胞系Namalwa：类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长。英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产α干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰

第16页：动物细胞培养的应用

动物细胞培养的应用作为反应器用于制药：EPO，tPA作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗组织再生与器官移植（个体克隆）：本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学细胞培养制药工艺细胞系

第17页：1.人源细胞系

1.人源细胞系WI-38：WistarInstitute（WI），二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗。MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对逆境有一定抗性，用于制备疫苗

第18页：2.哺乳动物细胞系

2.哺乳动物细胞系CHO细胞：Chinesehamsterovary，亚二倍体。多种衍生突变株。贴壁型生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞。药物：tPA、EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶I细胞培养制药工艺细胞系

第19页：2.哺乳动物细胞系

2.哺乳动物细胞系BHK－21：babyhamsterkidney成纤维样细胞，非整倍体，用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。上市重组凝血因子Ⅷ

第20页：2.哺乳动物细胞系杂交瘤细胞

2.哺乳动物细胞系杂交瘤细胞：hybridoma脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。应用：抗体药物生产。亲本鼠：小鼠，BALB/c；大鼠，Lou

第21页：3.鸡胚流感疫苗

3.鸡胚流感疫苗2005，Chiron'sflucellculturevaccine：Madin-DarbyCanineKidney(MDCK)cellline：Movingfromegg-basedtocell-basedinfluenzavaccineproduction细胞培养制药工艺细胞系

第22页：4.昆虫细胞系

4.昆虫细胞系Sf21：秋粘虫Spodopterafrugiperda。Sf9：从SF21中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清培养基的搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：粉纹夜蛾Trichoplusiani。表达能力比Sf9高20多倍，能悬浮培养。生产抗体、试剂盒，生物学研究细胞培养制药工艺细胞系

第23页：制药动物细胞小结

本节小结

• 动物细胞结构与功能：
• 代谢场所，合成，修饰，分泌动物细胞种类：
• 原代与传代细胞，二倍体细胞，有限与连续细胞系生产用细胞系：
• 人源，哺乳动物源，昆虫细胞系细胞培养制药工艺细胞系

第24页：制药动物细胞思考题

思考题

1. 离体动物细胞对葡萄糖和谷氨酰氨的代谢特征是什么？
2. 合成、修饰、分泌功能与制药有何关系？
3. 2分析原代与传代细胞，有限与连续细胞系的异同点，举例说明制药方面的应用。3最常用的两种药物生产哺乳动物源细胞系是什么，有什么特点？

第25页：第四章动物细目录

第四章动物细目录

• 制药动物细胞
• 动物细胞的生产特征
• 动物细胞培养基制备
• 动物细胞培养技术
• 重组人红细胞生成素的生产工艺

第26页：4.2动物细胞的生产特征

4.2动物细胞的生产特征凡对培养条件要求严格凡对培养基组成要求高凡天然结构与活性的药物生产特征

第27页：1.对培养条件要求

• 1.对培养条件要求严格动物细胞对周围环境十分敏感
• 无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界
• 物理化学因素:渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害
• 与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求严格地多

第28页：1、温度哺乳动物细胞最佳培养温度为

1、温度哺乳动物细胞最佳培养温度为37℃鸡细胞为39℃～40℃;昆虫类细胞为25℃～28℃。耐受温度范围较窄，35℃～37℃细胞受伤:39℃～40℃1小时，但能恢复。受伤严重:41℃～42℃，部分可恢复。死亡:43℃以上

第29页：2、氧气动物细胞生长必须有氧气

2、氧气动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。离体培养的气体：含有5％CO2和95％空气，其中氧浓度为21％。高氧环境:O2浓度60%以上，对细胞毒性较大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。有时充以N2气稀释O2浓度

第30页：3、pH值低于

3、pH值低于6.8或超过7.6会对细胞产生严重影响甚至使细胞死亡。机体细胞的pH范围为6～8，而且在血液和体液中，变化范围很小。人体:血液pH比较恒定，7.36～7.44。低于7.05发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒生产特征

第31页：4、渗透压正常血浆渗透压为

4、渗透压正常血浆渗透压为280～310mOsm/kg高渗溶液:高于310mOsm/kg低渗透压溶液:低于280mOsm/kg。动物细胞对渗透压有较强的耐受性离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。增减NaCl的浓度调整渗透压，每增加1mg/mlNaCl，渗透压增加32mOsm/kg

第32页：2.对培养基组成要求

• 2.对培养基组成要求高动物细胞对培养基的要求高
• 完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物
• 12中必需氨基酸
• 8种以上维生素
• 多种无机盐和微量元素
• 多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质
• 能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨
• 氮源：氨基酸单体化合物动物细胞制药生产特征

第33页：3.天然结构

3.天然结构与活性的药物完善的翻译后蛋白质修饰功能游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋白，多数为糖蛋白。修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。动物细胞制药生产特征

第34页：4.生产工艺特征产品与天然的产物一致

4.生产工艺特征产品与天然的产物一致：适于临床使用动物细胞生产：70％蛋白质药物。培养工艺：难度大，产量低，成本高。胞外分泌产物：分离纯化简单。有潜在的血源性污染危险

第35页：Q培养条件要求

Q培养条件要求：Q培养条件要求Q培养基组成要求Q生产药物特征小结生产特征动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第36页：动物细胞的生产特征思考题

思考题

1. 动物细胞制药培养条件有哪些要求，为什么？
2. 2动物细胞培养可优先用于生产哪些药物？
3. 3比较分析大肠杆菌、酵母、动物细胞系统制药的优缺点，如何选择应用？

第37页：5.重组人红细胞生成素的生产工

5.重组人红细胞生成素的生产工：1.制药动物细胞2.动物细胞的生产特征3.动物细胞培养基制备4.动物细胞培养技术5.重组人红细胞生成素的生产工

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第38页：4.3动物细胞培养基制备

4.3动物细胞培养基制备：4.3动物细胞培养基制备培养基组成成分培养基种类培养基质量控制培养基制备动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第39页：4.3.1培养基组成的成分糖类

4.3.1培养基组成的成分糖类：4.3.1培养基组成的成分糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第40页：1、糖类．糖类提供细胞生长的碳源和能

1、糖类．糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量ATP。不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。．不能利用:多糖、双糖、寡糖等聚合物。．利用：单糖单体化合物。．主要是葡萄糖培养基制备

第41页：2、氨基酸♦氮源作用♦不能利用

2、氨基酸♦氮源作用♦不能利用:多肽、蛋白质等高分子聚合物。♦利用：氨基酸等单体化合物。♦12种是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。♦必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长♦谷氨酰胺:重要碳源和能源

第42页：3、维生素♦作用

3、维生素♦作用：一类微量的小分子有机生物活性物既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，对代谢和生长起调节和控制作用。♦水溶性维生素：B族维生素和维生素C♦脂溶性维生素：维生素A、D、E、K四种

第43页：4、无机盐类♦作用

4、无机盐类♦作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活性，细胞构成成分；♦参与生理电活动；♦维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。♦胞外无机盐对维持正常生长环境很重要

第44页：5、生长类因子与激素♦作用

5、生长类因子与激素♦作用：对细胞的生长有刺激作用♦贴附因子：细胞的贴壁生长必需。♦脂类化合物：必需的，类脂及其前体和血清常平行使用。♦铁传递蛋白：离子载体

第45页：4.3.2动物细胞培养基的种类

4.3.2动物细胞培养基的种类：4.3.2动物细胞培养基的种类天然培养基合成培养基无血清培养基培养基制备动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第46页：1.天然培养基概念

1.天然培养基概念：直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液。特点：营养价值高，成分复杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量生产使用。应用：许多细胞系和原代及传代

第47页：2.合成培养基概念

2.合成培养基概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基。组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。特点：组分稳定，容易配制。缺点：不能直接使用；需要添加5％-20％血清，才能培养。已有几十种合成培养基，大部分已商品化

第48页：血清

含有基本的营养成分

补充合成培养基成分的不足

脂肪酸和微量元素

细胞生长所必需，磷脂质、胆固醇、前列腺素E，铜、锌、钴、钼、硒

激素和生长因子

细胞增殖、分化，胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、皮质醇、雌二醇

贴附和伸展因子

细胞贴壁所需，纤维结合蛋白、软骨素、胶原等

载体蛋白

白蛋白、转铁蛋白，金属、激素、维生素和脂类结合，带入细胞培养基制备

其他要点

血清(Serum)成分与作用

第49页：血清

血清(Serum)成分与作用·蛋白酶抑制剂：降解细胞死亡释放的蛋白质；消除毒素和金属的毒性。·蛋白质：抗机械剪切，保护细胞免于损伤的作用·缓冲物质：K、Na、Cl、Fe、Ca、葡萄糖等，稳定pH和渗透压·来源：胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清。·应用于许多细胞系和原代及传代

第50页：血清

血清(Serum)成分与作用·质量不稳定：个体差异大，批次间一致性差，·血源性污染：病毒、真菌、支原体污染的可能性·某些成分对细胞有毒性·分离纯化：增加难度·干扰某些生物测定·增加成本培养基制备

第51页：2.合成培养

2.合成培养MEM：minimumessentialmedium，12种aa、8种VBME：basalmediumEagle’sDMEM：Dulbecco’smodifiedEagle’smediumGMEM：Glasgow’smodifiedEagle’smediumJMEM：Joklik’smodifiedEagle’smediumRPMI1640：RoswellParkMemorialInstitute培养基制备

第52页：3.无血清培养基概念

3.无血清培养基概念：全部用已知成分组配、不加血清的合成培养基。组成：合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子量营养因子。特点：提高了培养的质量，避免血清带来的麻烦，产品纯化容易，组分稳定，大量配制

第53页：3.无血清培养基种类Ⅰ类

3.无血清培养基种类Ⅰ类：无蛋白质成分，化学成分完全明确，只适用于一些特定细胞系。Ⅱ类：含有纯化蛋白和激素，应用广，二倍体，原代及确立细胞系，相对比较昂贵。Ⅲ类：非确定生物添加剂取代血清，化学成分不太明确。可以灭菌，价格低廉

第54页：4.3.3培养基质量的控制

4.3.3培养基质量的控制：4.3.3培养基质量的控制培养用水质缓冲液生理盐水和平衡盐溶液其他成分配制培养基制备动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第55页：1、培养用水质必需使用纯净水配制

1、培养用水质必需使用纯净水配制：1、培养用水质必需使用纯净水配制培养基水存放时间不宜超过2周普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物和热源，达到纯净水标准

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第56页：2.缓冲液弱酸与弱酸盐

2.缓冲液弱酸与弱酸盐：碳酸氢钠/碳酸体系弱碱与弱碱盐：磷酸二氢钠/磷酸氢二钠体系有机缓冲液：MOPS、TES、HEPES、DIPSO作用：pH恒定。应用：缓冲剂配制，进一步配制其他溶液

第57页：3.生理盐水和平衡盐溶液

3.生理盐水和平衡盐溶液生理盐水：调节渗透压的盐溶液，0.9%NaCl等渗能力平衡盐溶液：balancedsalinesolution,BSS生理盐水，缓冲剂与指示剂、无机盐、葡萄糖作用：满足细胞对盐离子、碳营养的要求；pH和渗透压的环境要求；直观观察pH

第58页：3.生理盐水和平衡盐溶液磷酸盐缓冲液

3.生理盐水和平衡盐溶液磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffersolution,PBS)：KCl、KH2PO4、NaCl、Na2HPO4配制而成。应用：培养物、器皿的洗涤液。生理盐水和平衡盐溶液：配制直接接触、长期培养的培养液

第59页：4.氨基酸配制用量

4.氨基酸配制用量：使用L型氨基酸，对于DL混合型氨基酸，使用量应该加倍。单独配制谷氨酰胺：溶液中很不稳定。100倍浓缩液，－20℃保存一般培养液中含量为1～4mmol/L

第60页：5.NaHCO3配制配成

5.NaHCO3配制配成：5.NaHCO3配制配成3.7％、5.6%、7.4%三种浓度过滤除菌或高压灭菌，4℃保存使用前加入，调节培养基pH

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第61页：6、培养基灭菌不含葡萄糖的溶液常规高

6、培养基灭菌不含葡萄糖的溶液常规高压灭菌。含葡萄糖时，采用过滤除菌；115℃，15min血清使用：需要灭活，过滤灭菌，按一定比例加入。4℃保存。出现沉淀、混浊时，要重新配制

第62页：动物细胞培养基制备小结

本节小结

• 培养基组成成分:碳氮源、维生素、生长因子及其他附加成分培养基种类：
• 天然、合成、无血清培养基培养基质量控制：
• 原料、水质、配制、灭菌培养基制备动物细胞制药

第63页：动物细胞培养基制备思考题

思考题

1. 动物细胞培养基组成成分及其作用是什么？
2. 与微生物培养基相比，有何特殊性？
3. 2生产用最适动物细胞培养基应该选择哪种？
4. 3如何控制动物细胞培养基的质量？

第64页：5.重组人红细胞生成素的生产工

5.重组人红细胞生成素的生产工：1.制药动物细胞2.动物细胞的生产特征3.动物细胞培养基制备4.动物细胞培养技术5.重组人红细胞生成素的生产工

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第65页：4.4动物细胞

4.4动物细胞：4.4动物细胞培养技术·动物细胞生长和基质依赖性·动物细胞培养基本过程·动物细胞大规模培养方法培养技术动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第66页：4.4.1细胞生长和基质

4.4.1细胞生长和基质：4.4.1细胞生长和基质依赖性生长基质接触抑制贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞兼性贴壁细胞培养技术动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第67页：1.生长基质概念

1.生长基质概念：growthsubstratum把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。胞外基质成分：多聚赖氨酸胶原

第68页：2.接触抑制概念

2.接触抑制概念：contactinhibition细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。有：大多数细胞无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）

第69页：3.贴壁依赖性细胞概念

3.贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-dependentcell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞大多数动物细胞都属于此类

第70页：4.非贴壁依赖性细胞概念

4.非贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-independentcell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞

第71页：5.兼性贴壁依赖性细胞概念

5.兼性贴壁依赖性细胞概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系

第72页：2、传代细胞培养

2、传代细胞培养：1、原代细胞分离与培养2、传代细胞培养4.4.2动物细胞培养基本过程培养技术动物细胞制药

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第73页：1.原代细胞培养－过程

1.原代细胞培养－过程动物组织或器官洗涤粉碎酶解消化离心或过滤培养液稀释细胞洗涤接种培养从体内取出组织或器官经过粉碎、消化而获得单细胞进行体外接种培养。37℃消化，胰蛋白酶，胶原酶工作浓度：0.1-0.3mg/ml

第74页：2.传代细胞培养－过程概念

2.传代细胞培养－过程概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。传代时期：刚刚全部汇合的细胞。消化方法：过程与原代细胞相同。传代的次数：不能无限次传代，保证特性防止细胞系之间、非细胞生物的污染要领：适宜的时期和方法，不要过度

第75页：4、固定化培养

4、固定化培养：1、单层贴壁培养2、悬浮培养3、微载体培养4、固定化培养4.4.3动物细胞大规模培养方法动物细胞制药培养技术

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第76页：1.单层贴壁培养——概念与过程

1.单层贴壁培养——概念与过程细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养过程。生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面；进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。数天就长满整个表面，形成致密单层细胞

第77页：1.单层贴壁培养——特点优点

1.单层贴壁培养——特点优点：容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。缺点：操作较繁杂，检测受到限制，培养条件难以均一，传质和传氧差，放大培养是瓶颈

第78页：2.悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮在

2.悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培养过程优点：操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标记而降低免疫能力。适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性

第79页：3.微载体培养概念

3.微载体培养概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程。优点：细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，减少了劳动强度，容易放大。兼具贴壁和悬浮培养的双重优点微载体，多孔微载体应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原

第80页：4.固定化培养．概念

4.固定化培养．概念：用物理、化学方法将细胞固定在载体介质上，然后进行悬浮培养。．应用：贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。．优点：细胞密度高、抗剪切力和污染，生产首选．方法共价交联：双功能试剂处理，细胞之间交联。吸附：物理吸附使细胞贴附在固体载体表面。包埋：细胞包埋在载体内部。微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内

第81页：动物细胞培养技术小结

本节小结

• 细胞生长的基质依赖性：
• 生长基质，细胞类型细胞培养基本过程：
• 消化，传代细胞大规模培养方法：
• 单层贴壁，悬浮，微囊化，固定化培养技术动物细胞制药

第82页：动物细胞培养技术思考题

思考题

1. 1基质依赖性与非依赖性细胞系对培养条件的要求有什么不同？
2. 2动物细胞培养的基本过程是什么，各步的目的是什么？
3. 3细胞大规模培养有几种方法，有何特点，如何选择应用？

第83页：5.重组人红细胞生成素的生产工

5.重组人红细胞生成素的生产工：1.制药动物细胞2.动物细胞的生产特征3.动物细胞培养基制备4.动物细胞培养技术5.重组人红细胞生成素的生产工

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第84页：4.5重组人红细胞生成素生产工艺

4.5重组人红细胞生成素生产工艺：4.5重组人红细胞生成素生产工艺1.概述2.细胞培养工艺3.分离纯化工艺

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第85页：4.5.1概述·天然红细胞生成素的发

4.5.1概述·天然红细胞生成素的发现与种类·理化性质·重组人红细胞生成素及其临床应用·重组人红细胞生成素表达研究概述

第86页：1、天然红细胞生成

1、天然红细胞生成1890：现象，低氧压下红细胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，166aa，活性类似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有较多的N-乙酰葡糖胺，总含糖量比EPO-β高

第87页：2、EPO的理化性质大小

2、EPO的理化性质大小：166aa糖链占分子量的39%。糖基化程度与准确性对活性影响很大。pI4.2～4.6，对热和pH变化相对稳定

第88页：3、重组人红细胞生成素第一代

3、重组人红细胞生成素第一代：两种，rhEPO-α和rhEPO-β。1990,OrthoBiotech,1989:Amgen,Epogen；ProcritCHO、BHK细胞系生产第二代：EPO突变体，2001,Amgen,Arasnep长效。二联体或三联体EPO：高活性，长效（3－5倍）适应症:肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。隔日注射一次，长效EPO：每周一次

第89页：4、rhEPO的表达研究

4、rhEPO的表达研究1由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。2SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达红细胞生成素3昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小4干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的

第90页：4、rhEPO的表达研究

4、rhEPO的表达研究5大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。6家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。7在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产

第91页：4.5.2CHO培养工艺·工程

4.5.2CHO培养工艺·工程：4.5.2CHO培养工艺·工程CHO细胞系建立·种子细胞制备·反应器培养工艺·培养过程控制培养工艺rhEPO

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第92页：1、工程

1、工程CHO细胞系共转染，筛选稳定表达的细胞系CHOdhfr－细胞载体：prEC，pDHFR培养工艺

第93页：稳定转染的筛选培养胰蛋白酶消

稳定转染的筛选培养胰蛋白酶消化，1：5稀释，在含有1nMMTX培养基上培养，3－4d更换培养基，培养10～14天，至性克隆出现。胰酶消化，1：5稀释，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX浓度逐次升高，筛选抗性克隆。抗性克隆培养于100mm培养皿中，按1：500稀释，继续培养3～5天，集落2-4mm。酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素

第94页：2．种子细胞制备

2．种子细胞制备1冻存的细胞株37℃水浴，无菌离心。2加适量DMEM培养基（10%小牛血清）。（3）37℃、CO2培养箱培养，连续传三代。（4）细胞消化后接种，制成接种细胞浓度

第95页：3．灌流培养

3．灌流培养1反应器灭菌：加纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，高压灭菌1.5h。2接种：排出PBS缓冲液，加DMEM培养基，接种。3贴壁培养：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。4扩增培养：80－100r/min。5灌流培养：控制温度、DO、pH值等培养条件，进行无血清培养基连续培养。6收获培养物，4℃－8℃保存

第96页：4、培养工艺过程控制

4、培养工艺过程控制(1)搅拌控制：接种后,搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。2温度控制：较为严格，恒定37℃3pH值控制：7.2-7.4,输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。(4)溶解氧控制：在50％-80％的范围内，通入氧气、空气或氮气的比例混合气体。5葡萄糖控制：流加补料6代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，减少对细胞损害

第97页：4.5.3rhEPO的分离纯化工艺

4.5.3rhEPO的分离纯化工艺：4.5.3rhEPO的分离纯化工艺·初级分离·精制纯化·产品质量控制

本页源文件为图示与关键词的并列提取，未保留换行结构，建议对照原课件图片核对工序顺序。

第98页：1．初级分离收获培养液

1．初级分离收获培养液：离心过滤：滤膜亲和色谱：NaCl－Tris平衡，梯度洗脱，收集活性洗脱峰透析：0.1mMTris，过夜，换液4次。过滤：0.22μm滤膜

第99页：2．纯化精制

2．纯化精制DEAE离子交换：NaCl-Tris梯度洗脱，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脱，收集活性洗脱峰。凝胶过滤：柠檬酸盐缓冲液洗脱，收集活性峰过滤：0.22μm滤膜。rhEPO产品：蛋白含量为1.2 mg/ml，其比活可为2×105IU/mg

第100页：4、EPO的质控与活性检测纯度

4、EPO的质控与活性检测纯度，蛋白质含量，分子量等体外活性：ELISA测定（原理免疫沉淀），单位unit（IU）体内活性：网织红细胞计数法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。比活性(specificactivity,U/mg)：单位重量蛋白质(mg)中所含的活性

第101页：EPO概述

·EPO概述：发现，种类，表达研究·培养工艺：工程菌建立，种子制备，灌流培养与控制·分离纯化工艺：初级分离，纯化精制小结

第102页：重组人红细胞生成素生产工思考题

思考题

1. 分析比较各种表达系统生产rhEPO的优缺点。2CHO培养生产rhEPO的基本工艺过程及其构建控制点是什么，为什么？
2. 3rhEPO分离纯化工艺中使用了哪些操作单元，为什么？