页数：36页文件大小：2.69 MB来源： 生化生产工艺学ppt课件
本课件讲解动物细胞的大规模培养，先列举疫苗、单克隆抗体、免疫调节剂等细胞培养产物并补充抗原抗体与单抗基础知识，再说明温度、pH、营养成分等培养环境与天然、合成培养基的配制，随后介绍悬浮、贴壁、固定化三类培养方法与气升式、中空纤维、流化床等反应器，最后展开分批、流加、半连续、连续与灌注培养及大规模培养工艺
本章教学内容：
在生物技术中，人们已广泛地围绕细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而许多有重要价值的蛋白质等生物物质必须借助动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等（表 11-1）。
大规模的动物细胞培养开始于本世纪 50 年代，经过多年研究开发取得了很大进展，但目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求。随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。
| 类别 | 代表产物 |
|---|---|
| 疫苗（人） | 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等 |
| 疫苗（动物） | 牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗 |
| 单克隆抗体 | IgG、IgM、IgA 等 |
| 免疫调节剂 | β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等 |
| 酶 | 尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素 P450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸脱羟酶等 |
| 激素 | 绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等 |
哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物侵害：淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白（即抗体），这些蛋白可在其他免疫系统蛋白帮助下与外来物质结合并抵消其生物学功能。抗体最早由德国微生物学家贝林发现。
对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。
要把抗体应用于临床诊断或治疗，必须制备单一类型的、只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。
补充内容（二）动物细胞培养步骤，一般按以下步骤进行：
一、动物细胞培养基——1、动物细胞培养的环境：影响动物细胞生长繁殖的环境因素很多，主要有温度、pH 值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。
思考：1、影响动物细胞生长繁殖的环境因素有哪些？2、动物细胞培养合适的 pH 值为多少？3、溶氧浓度过高过低对细胞生长有何影响？4、细胞代谢产物 CO2 对细胞生长有何作用？
思考：1、天然培养基有哪些，有何优缺点？
2、血清和血浆的制取：血液由红细胞、白细胞、血小板和血浆组成。高速离心后分三层，上层为血浆（占 40% 多）；将血浆冷冻到 −30 ℃ 后离心分层，上层为血清，下层为少量杂蛋白。
3、最广泛使用的血清是什么动物血清，它有何营养成分？
组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，因血清中含有大分子蛋白质和核酸等丰富营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的毒性起一定作用。血清来源动物有小牛、胎牛、马、兔以及人等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。优质血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。
目前合成培养基种类已有数十种，大多数是为适应某种组织细胞生长而在某种合成培养基基础上改良而来。较为常用的有 199 培养液、Eagle（MEM、DMEM）培养液、RPMI1640 培养液、HAM 培养液等（表 11-2 为常用培养基的成分和配方）。
思考：1、目前较常用的合成培养基有哪些？2、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？3、无血清培养液由哪两部分组成（教材 P208）？
| 性质 | 微生物细胞 | 动物细胞 |
|---|---|---|
| 大小 | 1—10 μm | 10—100 μm |
| 代谢调节方式 | 内部 | 内部和激素 |
| 营养要求 | 宽松，可利用多种底物 | 苛刻 |
| 生长速率 | 倍增时间一般为 0.5—2 h | 倍增时间一般为 12—60 h |
| 机械强度 | 较好 | 很差，缺乏保护性细胞壁 |
| 环境适应 | 好 | 差 |
| 比较项目 | 微生物细胞 | 动物细胞 |
|---|---|---|
| pH 控制 | 添加酸、碱 | CO2-HCO3 缓冲液 |
| 搅拌速度 | 速度快、范围广 | 较慢 |
| 溶氧控制 | 改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度 | 改变进入气体的氧浓度 |
| 培养基灭菌方法 | 高温蒸煮 | 过滤 |
| 培养时间 | 几小时—几天 | 几天—3、4 周 |
| 对水纯度的要求 | 较低 | 很高 |
动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，可采用与微生物培养类似的悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，需附着于带适量电荷的固体或半固体表面生长。
思考：1、动物细胞培养有哪三种类型？2、悬浮培养有何优缺点？
在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂并很快进入对数生长期，一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。
细胞贴壁一般分为几个步骤：贴壁因子吸附于培养表面 → 细胞与表面接触 → 细胞贴壁于培养表面 → 贴壁细胞在培养表面上扩展（图 11-1）。
思考：在贴壁培养依赖性细胞中，请比较滚瓶培养系统和微载体培养系统？
常用的细胞固定化方法主要有：吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。
三、动物细胞培养生物反应器：自 70 年代以来，用于动物细胞培养的反应器种类越来越多、规模也越来越大。根据用途有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用等，大致包括塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、桨式与棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式与双层笼式通气搅拌反应器、空气提升式反应器等。
1、气升式细胞培养生物反应器（图 11-2）：气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管，使中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，也有采用外循环式。
优点：与搅拌式反应器相比，产生的湍流温和而均匀、剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，细胞损伤率比较低；采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀分布于培养基中。
溶氧控制可通过自动调节进入空气的速率实现；pH 值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。
| 细胞系 | 抗体类型 | 培养瓶 | 滚瓶 | 气升式 | 气升式/传统 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | IgG | 14 | 20 | 86 | 5.1 |
| 2 | IgM | 70 | 127 | 295 | 3.0 |
| 3 | IgG | 9 | 10 | 73 | 7.7 |
| 4 | IgG | 28 | 30 | 100 | 3.4 |
| 5 | IgG | 60 | 76 | 260 | 3.8 |
| 6 | IgM | 20 | 25 | 112 | 5.0 |
| 7 | IgG | 30 | 38 | 200 | 5.9 |
| 8 | IgG | 120 | 100 | 350 | 3.2 |
由表可见，与传统方法（培养瓶和滚瓶）相比，气升反应器的抗体产量平均提高 4.6 倍（抗体产量单位：mg/L）。
2、中空纤维管生物反应器（图 11-3）：用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度最高可达 109/mL 数量级；若控制系统不受污染，能长期运转。
反应器设培养基入口与出口，以及空气与 CO2 的进出口。
中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体（重点掌握内容）。
思考：通气搅拌反应器有哪些型式？
4、流化床生物反应器（图 11-7）：基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是流态化的固体是带有细胞的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动，不断提供细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时不断加入新鲜培养液，并不断排除培养产物或代谢产物。
系统组成：反应塔、气体交换氧气回流、营养液泵、加热器、pH 传感器、T、DO、CO2 检测点与收获口。
| 培养类型 | 细胞类型 | 细胞密度（个/mL） |
|---|---|---|
| 流化床 | 杂交瘤 | 0.3×108 |
| 流化床 | 贴壁依赖性细胞 | 1.3×108 |
| 恒化器 | 杂交瘤 | 2×106 |
| 微载体搅拌釜 | 贴壁依赖性细胞 | 0.2×107—2×107 |
此外，无泡沫搅拌生物反应器作一般了解。
在细胞分批培养过程中不向培养系统补加营养物质，只向培养基通入氧，能够控制的参数只有 pH、温度和通气量，因此细胞所处的生长环境随着营养物的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下，因而分批培养并不是一种很好的培养方式（图 11-8 为分批式培养过程的特征）。
细胞分批式培养的生长曲线如图 11-9 所示，培养过程中细胞的生长可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期五个阶段。
思考：为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？
流加式培养只是向培养系统补加必要的营养成分以维持营养物质的浓度不变，由于能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态（图 11-11 为流加式培养过程的特征）。
根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式：
与分批式培养和半连续式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处的环境条件长时间地稳定，使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。由于连续不断地收获产物并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。
思考：请比较半连续式培养和连续式培养？
动物细胞的连续培养一般采用灌注培养（图 11-14 为细胞灌注培养系统实例，图 11-13 为灌注培养过程的特征）：把细胞接种后进行培养，一方面连续向反应器中注入新鲜培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于营养不断的状态。
高密度培养动物细胞时必须确保补充足够的营养并除去有毒的代谢物，灌注培养用新鲜培养液进行灌注可实现上述目的；通过调节灌注速度，可把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。
灌注培养的优越性不仅在于大大提高细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化（表 11-12 及图 11-14），已应用于许多不同的培养系统中，规模已达几百升。
| 指标 | 分批培养 | 半连续培养 | 灌注培养 |
|---|---|---|---|
| 纯化收率（%） | 82 | 16 | 5 |
| 纯化物质的相对产量 | 1 | 13.3 | 7.4 |
| 比活性（IU/mg tPA） | 114.4 | 391.3 | 392.6 |
说明：源文件本页数值为连续文本，各行数值按出现顺序推定，建议对照教材表 11-12 原表复核。
5、动物细胞大规模培养工艺（图 11-15）：先将组织切成碎片，用溶解蛋白质的酶处理得到单个细胞，再离心收集细胞；将细胞植入营养培养基使其增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中扩大培养。
按照产物的不同形式进行产物分离纯化：
图 11-15 给出大规模动物细胞培养工艺流程图，包括细胞培养反应器、提取、诱生剂、纯化、浓缩等单元。
第十一章动物细胞大规模培养内容结束。本章重点为动物细胞培养基、悬浮与贴壁培养、各类生物反应器及灌注培养工艺。
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