第1页：核酸与核苷酸概述
- 核酸
- 一类重要的生物大分子，是生物遗传物质；生物体中的各种蛋白质乃至细胞的每种组分都是核酸顺序编码的信息产物；包括 DNA 和 RNA（mRNA、tRNA、rRNA）两大类
- 核苷酸
- 核酸的组成单位，是能量代谢转换过程中能量交换的“货币”
第2页：碱基的结构和种类
- 嘌呤碱：腺嘌呤（Adenine）、鸟嘌呤（Guanine）
- 嘧啶碱：胞嘧啶（Cytosine）、尿嘧啶（Uracil）、胸腺嘧啶（Thymine）
- 一些稀有碱基
- 核糖的结构和种类
第3页：核苷与核苷酸的结构
核苷的结构及主要核苷、核苷酸的结构见本页图示。
核苷酸的生物学功能：
- 细胞中的携能核苷酸
- 作为细胞通讯的媒介
- 是许多酶辅助因子的结构成分
第4页：核苷酸的生物学功能
- 细胞中的携能核苷酸：ATP 和 ADP（GTP、GDP、CTP、CDP、UTP、UDP）
- 一些核苷酸是细胞通讯的媒介（第二信使分子）：cAMP、cGMP
- 核苷酸是许多酶辅助因子的结构成分
第二节 磷酸二酯键与多核苷酸：核苷酸磷酸基团的转移、多核苷酸的合成。
第5页：多核苷酸链与碱基氢键
- 多核苷酸链的简单表示
- 核苷酸的紫外光吸收性质
- 氢键的形成：Watson 与 Crick 于 1953 年确定 A—T（U）、C—G 之间形成氢键
第6页：DNA是遗传物质的证据
- 1928 年 Frederick Griffith 与 1944 年 O. Avery 等的有毒肺炎双球菌转化实验
- 1952 年 Hershey 与 Chase 的细菌病毒 T2（噬菌体）标记实验
Chargaff 规则：
- 不同物种 DNA 碱基组成一般不同
- 同一物种不同组织 DNA 碱基组成相同
- DNA 碱基组成不因个体年龄、营养、环境而改变
- 任何 DNA 的嘌呤残基总数等于嘧啶残基总数：[A]=[T]，[G]=[C]
第7页：DNA双螺旋结构要点
- 两条 DNA 链围绕同一中心轴缠绕形成右手双螺旋
- 两条链反向互补平行，亲水性主链位于螺旋外侧
- 嘌呤与嘧啶具疏水性、近乎平面，相互贴近堆积在双螺旋内部并垂直于螺旋轴
- 维持力为互补碱基对的氢键（A=T、C≡G）和碱基堆积力（疏水作用与范德华力）
- 一个螺旋（360°）含 10（10.5）个碱基对，每个螺旋 3.4 nm
第8页：DNA的二级结构类型
- 由于两条链间的空间关系，DNA 产生一条大沟和一条小沟
- 两条 DNA 链的互补性可以进行互补子代链的合成
- 一级结构
- 核苷酸的排列顺序
- 二级结构
- A 型、B 型、Z 型及其模型
第9页：A型B型Z型与特殊二级结构
- 三种二级结构形成的原因
- 三种二级结构的比较
- 特殊的二级结构：回文结构和镜像重复
- H-DNA
第10页：DNA三级结构与RNA种类
- DNA 三级结构
- DNA 双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链与二级结构单元间的相互作用以及 DNA 的拓扑特征；超螺旋结构是三级结构的一种
- rRNA
- 核糖体的结构成分；核糖体作为 RNA 和蛋白质的复合物负责细胞内蛋白质的合成，是蛋白质合成的场所
第11页：mRNA与tRNA的功能
- 信息 RNA（mRNA）：携带一个或几个基因信息到核糖体，指导蛋白质的合成
- 转移 RNA（tRNA）：把 mRNA 的信息准确翻译成蛋白质中氨基酸顺序，并将氨基酸准确转移至核糖体
RNA 的结构：一级结构、高级结构，以及 mRNA、tRNA 和 rRNA 的结构特征。
第12页：mRNA帽子与tRNA三叶草结构
mRNA 的帽子结构：I 型 m⁷G⁵′ppp⁵′NmpNp；II 型 m⁷G⁵′ppp⁵′NmpNmpNp。
- tRNA 一般含 73–94 个核苷酸，单链，主要以氢键连接
- 一种氨基酸对应一个 tRNA，有的二个或更多，体内有 32 种 tRNA
- 二级结构为典型的发卡结构，分子呈三叶草形
- 每分子有四个氢键区、三个环和一个臂：D 环、反密码子环、TψC 环和氨基酸臂
- 所有 tRNA 有 8 个或更多修饰碱基，主要是甲基化；5′ 端大多数是鸟嘌呤核苷酸，3′ 端是 CCA 序列
第13页：DNA的变性与复性
- tRNA 链内碱基配对：A-U、G-C、G-U
- rRNA 的结构特征
- 变性
- 在温度、pH 等因素影响下，DNA 双螺旋区的氢键断裂和碱基堆积力破坏，使双链变成单链，但不发生共价键断裂；变性 DNA 黏度降低，紫外吸收增加（增色效应）
- 复性
- 变性因素消除后，两条链通过碱基配对重新形成双螺旋，紫外吸收降低
- 淬火
- 加热变性后使溶液急速降至零度，DNA 不能复性而保持单链状态
第14页：退火、复性动力学与Tm
- 退火
- 变性 DNA 缓慢冷却时可以复性，此过程称为退火
- 复性动力学
- 基本符合二级反应动力学：第一步缓慢，两条链随机碰撞找到配对部分；第二步快得多，其余部分像拉锁链一样迅速形成双螺旋
- 熔解温度 Tm
- 加热变性时双螺旋结构失去一半（紫外吸收增加值达总增加值一半）时的温度；一般在 82–95 ℃，每种 DNA 都有特征性 Tm 值
第15页：核酸分子杂交与探针
- 分子杂交
- 不同来源的核酸链（DNA 或 RNA）根据顺序互补性，在退火之后形成双螺旋的过程；广泛用于基因和 RNA 的分离与鉴定
- 探针
- 互补于靶基因顺序的单链 DNA 或 RNA 片段，通常带有放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高辛等标记物
原理：碱基互补。方法：Southern blotting。
第16页：核酸杂交应用与PCR
- 杂交应用：生物进化研究；疾病预测；癌基因的检查（基因芯片）；法医和刑侦鉴定等
- PCR
- 聚合酶链反应，是一种体外扩增 DNA 的生物技术，1984 年 Kary Mullis 发明；广泛用于基因克隆、探针制备、刑侦鉴定、DNA 重组、癌基因检查、遗传病诊断、定位诱变与基因改造
- 核酸的紫外吸收
- 纯 DNA 的 A₂₆₀/A₂₈₀ 应大于 1.8，纯 RNA 该比值应达到 2.0
第17页：核酸的紫外吸收与甲基化
对于纯样品：260 nm 吸光度为 1 时，相当于 50 μg/mL 双链 DNA，或 40 μg/mL 单链 DNA（或 RNA），20 μg/mL 寡核苷酸。
- DNA 由双链变成单链的变性过程导致紫外吸收增加，即增色效应
- 脱氨基作用和脱氧核苷酸的水解
- 紫外线和一些化学因子对 DNA 的损伤
- DNA 的酶法甲基化：甲基供体为 S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为各种被修饰碱基
第18页：核酸酶与限制性内切酶
碱基的甲基化修饰不是随机的，而是限于一定的顺序或 DNA 的某一区域，在甲基化酶的作用下进行，甲基化是可逆的。
- 核酸酶
- 能水解核酸的酶，都是磷酸二酯酶；按底物分为核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶；按作用方式分为内切核酸酶（从内部切割产生片段）与外切核酸酶（从一端逐个切断释放单核苷酸）；按断裂方式分为 3′-核酸酶和 5′-核酸酶
- 限制性内切酶
- 从细菌中分离的一类专门识别和水解特定核苷酸序列的内切酶，用于防御外来 DNA；自身因甲基化作用而不受损害
第19页：限制酶图谱与Sanger测序法
- 限制性内切酶约 1000 多种
- 限制性内切酶图谱：各酶切点在某一 DNA 分子或片段上的排列，切点间距离以碱基对（kbp→mbp）表示，故又称物理图
- 双脱氧末端终止法（Sanger，1977）
- 建立 4 套 DNA 合成体系，每套含一种同位素（³²P 或 ³⁵S）标记的 dNTP 和一种 ddNTP；ddNTP 缺少 3 位羟基使链延伸终止，得到长短不一并带标记的四组片段，经电泳分离、X 光片曝光后可读出 DNA 顺序
第20页：基因的概念与基因组
- 基因
- 经典生物学：决定或影响生物体某一性状或表现型的染色体上的某一部分；分子水平：遗传物质上“基因编码一个酶”或“基因编码一个蛋白”的片段；生物化学：为各种多肽链或 RNA 顺序编码的 DNA 片段，也可称为顺反子
- 基因组
- 一个细胞中所有基因和基因间 DNA 的总和；病毒 DNA、质粒 DNA 也称病毒基因组和质粒基因组
第21页：天然DNA分子的特征
- 病毒 DNA 分子：基因组可由 RNA 或 DNA 组成，一般只含一种；几乎所有植物病毒和某些细菌、动物病毒是 RNA 病毒，RNA 病毒基因组较小，DNA 病毒基因组分子量变化较大
- 细菌染色体 DNA：环形，只含一个染色体，所有基因几乎都是单拷贝
- 细菌质粒 DNA：染色体外遗传因子，环状、分子量小，能复制产生子代质粒，携带的抗性基因可使寄主菌产生抗性
- 真核细胞染色体 DNA：线形 DNA 分子，含高重复顺序与中等重复顺序，重复单位小于 10 bp，以同向重复方式串联
- 一个人体细胞 DNA 全长约 2 m
第22页：DNA超螺旋结构
- 超螺旋
- 螺旋的螺旋；细胞内 DNA 都是以超螺旋形式存在的，超螺旋是 DNA 三级结构的重要特征
- 超螺旋 DNA
- 双螺旋的轴再弯曲缠绕时 DNA 即处于超螺旋状态，是结构张力的表现
第23页：连系数与DNA拓扑异构酶
- 连系数 L
- 一个闭合环形 DNA 分子两条链以右手方向相互缠绕的次数
- 比连系差 σ
- σ = (L − L₀)/L₀，L₀ 为松弛状态的连系数，σ 也称超螺旋密度，用于衡量 DNA 超螺旋水平
- I 型拓扑异构酶
- 临时切开双链中的一条链，使切口一端围绕未切割链旋转一圈后重新连接，每次作用改变连系数 1
- II 型拓扑异构酶
- 同时切开 DNA 的两条链，一次作用改变连系数 2
第24页：核小体与染色质结构
- 核小体
- 染色质的基本结构单位；146 bp DNA 紧紧缠绕由 H2A、H2B、H3 和 H4 形成的八聚体组蛋白核心，每两个核小体间有 54 bp 连接成串珠状
- 30 nm 核小体纤维
- 核小体在 DNA 连接下再以线圈形盘绕形成
串珠状核小体的电子显微镜图及人染色体的包装过程见本页与下页图示。
第25页：染色体的包装过程
- a. 双螺旋 DNA：2 nm
- b. 染色质形式（核小体链，每个核小体 200 bp）：11 nm
- c. 螺线管（纤丝每圈 6 个核小体）：30 nm 核小体纤维
- d. 突环：约 0.25 μm，20 000–100 000 bp，与核骨架相连；核骨架由几种蛋白组成，以 H1 和 II 型拓扑酶为主
- e. 玫瑰花结：18 环、6 环，30 个梅花结为一个螺旋圈
- f. 染色体：每个染色单体含 10 个螺旋圈
第26页：DNA与RNA的分离方法
制备核酸最重要的是防止降解和变性：防止过酸过碱破坏磷酸二酯键（一般在 pH 4–10 下进行）、避免剧烈搅拌；防止核酸酶（DNase、RNase）作用。评定指标包括相对分子量、紫外吸收、沉降系数、电泳迁移率、粘度等。
- DNA 的分离
- 1 mol/L NaCl 溶解 DNP、0.14 mol/L NaCl 沉淀 DNP，苯酚抽提去除蛋白；氯仿-异戊醇与 DNP 溶液震荡借助表面变性除去蛋白；氯化铯密度梯度离心
- RNA 的分离
- 需无 RNase 环境：玻璃器皿高温焙烤、塑料用品高压灭菌或 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理；破碎细胞时加入强变性剂（异硫氰酸胍）；加入 RNasin 抑制剂。常用异硫氰酸胍/酚/氯仿抽提法与胍盐/氯化铯密度梯度离心法
第27页：核酸的含量测定与电泳
核酸含量测定主要采用紫外分光光度法。
核酸密度测定（氯化铯密度梯度离心）：G-C (mol%) = (ρ − 1.660)/0.098 × 100，可用于测定 DNA 中 G-C 含量、研究溶液中核酸构象及制备核酸。
- 琼脂糖凝胶电泳
- 浓度 1%–1.5%，EB 染色
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 分辨率可达 1 bp，常用于测序
