第1页：蛋白质的氨基酸分类
第一章 蛋白质 · 第一节 蛋白质的基本结构单位——氨基酸。本页给出氨基酸的基本结构与分类框架。
- 非极性氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸
- 极性不带电荷氨基酸：丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸
- 酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸
- 碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸
第2页：不常见与非蛋白质氨基酸
本页承接氨基酸分类，给出两类特殊氨基酸。
- 蛋白质中不常见的氨基酸：由常见氨基酸经翻译后修饰形成
- 非蛋白质氨基酸：不参与蛋白质组成，多以代谢中间物形式存在
第3页：氨基酸的一般物理性质
- 外观性状
- 无色晶体或粉末状
- 熔点
- 较高，约 200–300 ℃
- 旋光活性
- L 型与 D 型氨基酸旋光方向相反、角度相同；使平面偏振光左偏者为左旋异构体，右偏者为右旋异构体
- 光学性质
- 具有旋光活性和紫外吸收
第4页：氨基酸的紫外吸收与等电点
芳香族氨基酸的紫外吸收峰：
芳香族氨基酸的紫外吸收峰| 氨基酸 | 吸收峰波长（nm） |
|---|
| 色氨酸 | 279 |
|---|
| 酪氨酸 | 275 |
|---|
| 苯丙氨酸 | 259 |
|---|
- 等电点 pI
- 一定 pH 下氨基酸分子所带正负电荷数相等、净电荷为零，此时溶液 pH 即为等电点；等电点时氨基酸溶解度最小
- pK 值
- 某种解离基团有一半被解离时的 pH 值
- pI 计算
- pI = 1/2(pK₁ + pK₂)；示例 pI = 1/2(2.34 + 9.60) = 5.97
第5页：氨基酸的化学反应
- 茚三酮反应
- 亚硝酸反应
- 2,4-二硝基氟苯反应（FDNB）
- 甲醛的反应
- 二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS-Cl）
- 氨基酸与酰化剂（苄氧羰酰氯）的反应
- α-羧基的成酯反应
- 侧链基团参加的反应
蛋白质的水解：酸水解（6 mol/L HCl，110–120 ℃，24 h）；碱水解（5 mol/L NaOH，110 ℃，24 h）。
第6页：氨基酸的分离鉴定方法
- 酶水解：条件温和，不破坏氨基酸
- 纸层析
- 薄层层析：硅胶、氧化铝、纤维素粉等
- 离子交换柱层析：离子交换树脂、原理与方法
第7页：蛋白质的一级结构与肽键
蛋白质的结构层次：一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构。
- 一级结构
- 蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置；是高级结构的分子基础，包含决定所有结构层次构象的全部信息
- 肽键
- 一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基之间脱去一分子水形成的共价键，又称酰胺键
- 肽链
- 多个氨基酸以肽键相连成链，称多肽（二肽、三肽……多肽）
第8页：一级结构测定的片段重叠法
肽链主链为 —N—C—C— 重复单位，侧链为 R 基；按氨基酸残基命名，有 N-末端与 C-末端；二硫键写作 —S—S—。
一级结构测定（片段重叠法）步骤：
- 提纯蛋白质样品
- 测定蛋白质的分子量和氨基酸组成
- 氨基酸末端分析（N-末端和 C-末端）
- 拆开二硫键
- 用化学法和酶法专一水解肽链成大小不等的一系列片段
- 分离纯化各肽段并采用 Edman 降解法测序
- 用重叠法推断肽链全部氨基酸序列
- 二硫键的定位（对角线电泳）
第9页：蛋白质二级结构与酰胺平面
- 二级结构
- 通过肽链上羰基氧和亚氨基氢之间的氢键，使肽链主链骨架局部区域形成有规则的空间排布，包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲
- 酰胺平面（肽平面、肽单位）
- C—N 0.147 nm，C=N 0.128 nm，肽键 0.132 nm，键长介于单键与双键之间
第10页：双面角、构象与构型
- Ψ 角
- 以 Cα—C 为轴的旋转角；顺式时 Ψ=0，顺时针旋转为正值，反时针为负值
- Φ 角
- 以 Cα—N 为轴的旋转角；顺式时 Φ=0，顺时针旋转为正值，反时针为负值；所有肽单位在同一平面时 Ψ 与 Φ 均规定为 180°
- 肽平面的意义
- 是蛋白质结构最小单位，限制了肽链的构象数
- 构象
- 分子内各原子或基团之间的相互立体关系，改变由单键旋转产生，不需共价键变化
- 构型
- 立体异构体中取代原子或基团在空间的取向，改变必须有共价键断裂
第11页：维持蛋白质构象的作用力
β-折叠：两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链的氨基与羰基氧形成氢键。
第12页：β-转角与超二级结构
β-转角（β-拐角）结构：在各种蛋白质中，可同时存在几种二级结构，也可只有一种二级结构。
- 超二级结构
- 二级结构相互靠近形成的聚集体，如 α-螺旋聚集体 αα 型、βαβ 型，β-折叠聚集体 βββ 型
- βCβ 结构
- 形成平行式 β-折叠的两段肽段之间存在较长无规卷曲的区域
第13页：蛋白质的结构域
- 结构域（domain）
- 较大的蛋白质中空间上可明显区分的相对独立的区域性结构，常见含 100–400 个氨基酸，至少约 40 个
- 结构域之间关系松懈，常由一段长短不等的肽链相连
- 对一个小分子来说，结构域与其三级结构是同一意思
- 从动力学角度，较长的多肽链先折叠成几个相对独立单位再盘绕成完整立体结构更为合理
第14页：纤维状蛋白质与角蛋白
- α-角蛋白
- 存在于皮肤、毛、发、角、鳞、蹄、爪
- β-角蛋白
- 蚕丝、蜘蛛丝的丝心蛋白，典型的反平行折叠片层以平行的方式堆积成多层结构
第15页：胶原蛋白的三股螺旋
胶原蛋白分布于腱、骨、软骨、牙、皮。原胶原分子由三股自身为左手螺旋的多肽链向右缠绕，形成右手三螺旋。
- 氨基酸组成与球状蛋白不同：Gly 和 Pro 含量很高
- 含 3 个不常见氨基酸：4-羟脯氨酸、3-羟脯氨酸和 5-羟赖氨酸
- 由 Pro 和 Lys 在脯氨酰羟化酶和赖氨酰羟化酶催化下于蛋白质合成后形成
- 有很长的 Gly—X—Y 顺序
- 原胶原分子在胶原纤维中按 1/4 错位有规律地首尾相接，并行排列成纤维束，电镜下呈现横纹区带
蛋白质的三级结构：球状蛋白质在二级结构、超二级结构乃至结构域基础上进一步折叠、卷曲，形成紧密的近似球形结构。
第16页：蛋白质的三级与四级结构
- 三级结构
- 包括多肽链中一切原子的空间排列方式，主要靠次级键（包括二硫键）维持
- 四级结构
- 独立折叠的球状蛋白质通过非共价键彼此缔合而成的聚合体结构；其中每个具独立三级结构的多肽链称亚基，以 α、β、γ 命名
- 肌红蛋白中只有 α-螺旋，免疫球蛋白中只有 β-折叠，磷酸丙糖异构酶中二者相间存在
- 肝乙醇脱氢酶：由两个相同亚基组成的二聚体
- 血红蛋白：α₂β₂ 四聚体
第17页：一级结构与功能的关系
蛋白质的一级结构决定其空间结构，空间结构又取决于一级结构（氨基酸的组成和顺序）。
- 一级结构的微小差别可导致生理功能的重大不同
- 实例：镰刀形红细胞贫血症（sickle-cell anemia）
第18页：蛋白质变性与复性
- 变性
- 二级结构以上高级结构的破坏，从而导致生物活性丧失的过程；本质是次级键（包括二硫键）的破坏
- 复性
- 变性蛋白在去除变性因素后重新恢复天然构象、恢复生物活性的现象
蛋白质的空间构象与其生物学功能密切相关，构象改变则生理功能随之消失。胰岛素结构：胰岛素原 84 肽，A 链 21 肽、B 链 30 肽、C 肽 33 肽。
第19页：血红蛋白与肌红蛋白的比较
血红蛋白与肌红蛋白的结构比较：
肌红蛋白与血红蛋白的分子组成比较| 蛋白 | 氨基酸数目 | 分子量 |
|---|
| 肌红蛋白 Mb | 153 | 17.2 kD |
|---|
| 血红蛋白 α 亚基 | 141 | — |
|---|
| 血红蛋白 β 亚基 | 146 | — |
|---|
| 血红蛋白 α₂β₂ | — | 64.45 kD |
|---|
本页另含原卟啉环和血红素分子的结构，以及氧的结合诱导血红蛋白分子构象变化的内容。
第20页：Bohr效应与BPG调节
- Bohr 效应
- 在代谢旺盛的组织，高 H⁺ 和 CO₂ 浓度促进氧的释放，有利于组织摄取氧；在肺部 pCO₂ 降低，有利于 Hb 结合氧
- 2,3-二磷酸甘油酸（BPG）
- 降低 Hb 对氧的亲和力，增加 Hb 的卸氧量；BPG 与去氧 Hb 结合于中央空穴部位
脱氧血红蛋白分子中存在盐键，稳定其低亲和力的紧张态构象。
第21页：抗原与抗体的基本概念
- 抗原
- 能引起免疫反应的任何大分子（包括蛋白、核酸、多糖、毒素等）或病原体（细菌、病毒等）
- 抗体（免疫球蛋白）
- 由肝、脾、淋巴结等组织网状内皮细胞合成的血浆糖蛋白，特异性强，专一识别相应抗原
IgG 的结构：含不变区与可变区结构域，轻链含二个结构域。
第22页：免疫球蛋白的分类
IgG 不变区结构域的构象、可变区结构域构象以及轻链的二个结构域见本页图示。
第四节 蛋白质的理化性质：蛋白质的胶体性质。
第23页：蛋白质的胶体与沉淀性质
- 胶体性质
- 分子量 1 万–100 万，颗粒 1–100 nm；稳定性来自水化层和双电层，并具有不可透性
蛋白质的沉淀作用：
- 可逆沉淀作用：盐析和盐溶
- 不可逆沉淀作用：重金属沉淀、生物碱试剂沉淀、有机溶剂沉淀、加热变性沉淀
蛋白质还具有两性性质和等电点，以及 280 nm 的紫外吸收性质。
第24页：蛋白质分离纯化的原理
蛋白质的沉降作用。
分离纯化的一般原理：根据蛋白质的酸碱性质、电荷情况、等电点、分子大小和形状、溶解度、稳定性、吸附性质（包括与其他小分子的亲和力）以及 280 nm 光吸收性质等。
- 离子交换柱层析法：支持介质为纤维素、凝胶等；交换剂分阴离子交换剂与阳离子交换剂
第25页：凝胶过滤与亲和层析
- 凝胶过滤法
- 根据样品分子量选择合适的介质；柱床要用缓冲液平衡稳定；可根据洗脱体积测定样品分子量
- 亲和层析法
- 利用蛋白质与专一配基的亲和力进行分离
蛋白质沉淀法：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法。
第26页：SDS-PAGE测分子量与纯度鉴定
- 凝胶过滤法
- 用于测定蛋白质分子量
- SDS-PAGE
- 支持介质为聚丙烯酰胺凝胶；SDS（十二烷基硫酸钠，CH₃(CH₂)₁₁SO₄Na）用量 1.4 g/g 蛋白；流程为聚胶—电泳—染色—脱色，用于分析分子量和纯度
蛋白质的纯度鉴定：电泳；等电聚焦（检查纯度，确定等电点）。
第27页：蛋白质含量的测定方法
- 紫外吸收法
- 280 nm、1 cm 光径下测定克分子浓度蛋白的吸收值
- 染料结合法（Bradford 法）
- 考马斯亮蓝 G-250，以 A₅₉₅/A₄₆₅（样品）对 A₅₉₅/A₄₆₅（对照）计算
