03 第三章 发酵工业培养基及其设计.pptx

第1页：第三章 发酵培养基

培养基

广义上讲是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时为微生物培养提供除营养外的其他所必须的条件。

发酵培养基的作用

满足菌体的生长，促进产物的形成。

第2页：发酵培养基的要求

发酵培养基的要求

1. 培养基能够满足产物最经济的合成
2. 发酵后所形成的副产物尽可能的少
3. 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应
4. 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等

第3页：培养基的类型：按纯度

第一节 培养基的类型及功能：培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型。

合成培养基

原料化学成分明确、稳定，适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律；营养单一，价格较高，不适合大规模工业生产。

天然培养基

采用天然原料，来源丰富（大多为农副产品）、价格低廉、适于工业化生产；原料质量不加控制会影响生产稳定性。

第4页：大肠杆菌常用两种培养基

培养大肠杆菌常用两种培养基

• M培养基（1L）：Na₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂ 0.011g，葡萄糖2-10，pH 7.0
• YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g，NaCl 10g，pH 7.2

第5页：培养基的类型：按状态与用途

• 固体培养基：适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产
• 半固体培养基：在配好的液体培养基中加入少量琼脂，一般用量为0.5%～0.8%，主要用于微生物的鉴定
• 液体培养基：80%～90%是水，配有可溶性或不溶性营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基
• 按用途：孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种

第6页：碳源的作用与来源

第二节 发酵培养基的成分及来源 一、碳源

• 作用：提供微生物菌种生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分，提供合成目的产物所必须的碳成分
• 来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃

第7页：工业上常用的葡萄糖

3、工业上常用的糖类 ①葡萄糖

• 所有的微生物都能利用葡萄糖
• 但是会引起葡萄糖效应
• 工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的质量指标

第8页：制糖工艺对糖液质量的影响

不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大，糖液质量直接影响发酵水平，需按指标控制。

第9页：糖蜜的来源与分类

糖蜜

制糖生产时的结晶母液，是制糖工业的副产物，主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜、葡萄糖蜜。

第10页：加工方法对甘蔗糖蜜的影响

不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响：不同加工工艺会改变糖蜜的杂质组成与含量，进而影响发酵使用效果。

第11页：糖蜜使用的注意点

糖蜜使用的注意点：除糖份外含有较多杂质，其中有些是有用的，但许多会对发酵产生不利影响，需要进行预处理。

• 谷氨酸发酵：有害物质为胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）、生物素（发酵控制）；预处理为澄清→脱钙→脱除生物素
• 柠檬酸发酵：有害物质为铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）；预处理用黄血盐

第12页：淀粉与糊精的使用

淀粉、糊精

使用条件是微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。

• 缺点：难利用、发酵液比较稠，一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶；成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等
• 优点：来源广泛、价格低；难利用，可以解除葡萄糖效应

第13页：碳源对α-淀粉酶发酵的影响

例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶，碳源对生长和产酶的影响

第14页：半纤维素酶碳源研究

半纤维素酶生产中的碳源研究（1.5g麸皮）：引自李江华，《无锡轻工大学学报》，2004。

第15页：碱性纤维素酶碳源影响

嗜碱芽孢杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响

• 结果：各种碳源相差不大
• 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型

引自苏勤，《林业化学与工业》，2004。

第16页：氮源的作用与无机氮源

二、氮源：主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物，分为有机氮源和无机氮源两大类。

• 无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水
• 特点：微生物吸收快，也称迅速利用的氮源；但迅速利用常会引起pH的变化，如 (NH₄)₂SO₄→2NH₃+2H₂SO₄，NaNO₃+4H₂→NH₃+2H₂O+NaOH

第17页：生理酸性物质与生理碱性物质

生理酸性物质

经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源，如硫酸铵。

生理碱性物质

菌体代谢后能产生碱性物质的无机氮源，如硝酸钠。

选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长；稳定和调节发酵过程中的pH。

第18页：毛霉产蛋白酶的初始pH

毛霉产蛋白酶的研究：初始pH的影响——pH偏酸比较好，对中性蛋白酶影响大。

引自陈涛，《中国酿造》，2004。

第19页：无机氮源对产酶的影响

无机氮源的影响：硫酸铵 > 硝酸铵 > 硝酸钠 > 尿素。

第20页：有机氮源的种类与成分

2、有机氮源

• 来源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟
• 玉米浆成分：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等

成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。

第21页：有机氮源的不稳定性

有机氮源成分复杂，可以从多个方面对发酵过程进行影响；另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。

第22页：氮源使用的相关问题

氮源使用的一些相关问题

• 有机氮源和无机氮源应当混合使用：早期用易同化的无机氮源，中期菌体代谢酶系已形成则利用蛋白质
• 有些产物会受氮源的诱导和阻遏，例：蛋白酶的生产
• 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
• 开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的课题

第23页：发酵培养基成分与来源（过渡页）

发酵培养基·发酵培养基的成分及来源：本节内容分隔页。

第24页：无机盐与微量元素

三、无机盐的微量元素

• 作用：各种不一样
• 来源：C、N源，以盐的形式补充
• 用量：根据具体的产品，以实验决定
• 使用注意点：对于其他渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素，在发酵过程中必须加以考虑

第25页：铁离子与磷酸盐的影响

例：铁离子——青霉素发酵中铁离子的浓度要小于20μg/ml，发酵罐必须进行表面处理。

B、使用时注意盐的形式（pH的变化）：例为黑曲霉NRRL-330生产α-淀粉酶时磷对酶活的影响。

第26页：生长因子

生长因子

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子，生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。

第27页：前体的概念

前体

指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

青霉素：分子量356；苯乙酸：分子量136。

第28页：前体用量的衡算

用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题。

• 例：6000单位/ml的青霉素G，青霉素＝6000×0.6（微克）＝36mg/ml
• 苯乙酸＝（36×136）/356＝13.8mg/ml＝1.38%
• 实际使用时的转化率在46-90%之间；某厂单耗为0.337（kg/10亿青霉素），转化率为13.8/[(0.337/0.6)×36]＝68%

第29页：前体的使用方法

用法：前体使用时普遍采用流加的方法。

• 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利，苯乙酸一般基础料中仅仅添加0.07%
• 前体相对价格较高，添加过多容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率

第30页：产物促进剂的概念

产物促进剂

指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

第31页：促进剂的作用机制

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的

• 有些促进剂本身是酶的诱导物
• 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产
• 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用
• 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子

第32页：水质的要求

五、水：对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。

• 水源质量的主要考虑参数：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量
• 对于酿造行业，水的重要性不言而喻
• 对于常规发酵，要求可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水

第33页：培养基设计与优化概述

第三节 发酵培养基的设计和优化：目前还不能完全从生化反应的基本原理推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

第34页：培养基成分选择的原则

一、培养基成分选择的原则

• 菌种的同化能力
• 代谢的阻遏和诱导
• 合适的C、N比 100∶0.2～2.0
• pH的要求

第35页：理论转化率与实际转化率

理论转化率

理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算所得出的转化率大小。

实际转化率

实际发酵过程中转化率的大小。

如何使实际转化率接近于理论转化率是发酵控制的一个目标。

第36页：酒精发酵理论得率计算

例：酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算

• 代谢总反应衡算式：C₆H₁₂O₆─→2C₂H₅OH+2CO₂
• 理论得率：Y＝2×46/162＝0.571

第37页：发酵培养基设计与优化（过渡页）

发酵培养基·发酵培养基的设计和优化：本节内容分隔页。

第38页：实验设计方法

（二）、实验设计

• 培养基成分的含量最终都是通过实验获得的
• 合理的实验方法：多因子实验，包括均匀设计、正交实验设计、响应面分析等

第39页：培养基设计的步骤

三、培养基设计的步骤

1. 根据前人的经验和培养基成分确定时必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分
2. 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分
3. 当培养基成分确定后，确定各成分最适的浓度，为减少实验次数常采用合理的实验设计方法

第40页：类胡萝卜素高产菌优化实例

类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化：类胡萝卜素的作用为色素、营养保健。

引自郭秒，《食品与工业发酵》，2004。

第41页：原培养基配方页

原培养基：类胡萝卜素高产菌Y11优化前的初始培养基配方。

第42页：初步确定可能的培养基成分

初步确定可能的培养基成分（以碳源为例）：根据经验与成本因素初选若干候选碳源。

第43页：单因子实验确定碳源

通过单因子实验确定适宜的培养基成分（以碳源为例）

• 考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源
• 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好

第44页：优化后的培养基配方

结果：优化后的培养基配方

• 碳源：乙酸钠 0.2%
• 氮源：氯化铵 0.2%
• 酵母膏 0.03%
• 无机盐：复合无机盐 0.05%

第45页：正交设计确定优化配方

正交设计确定优化的配方：在单因子实验基础上，通过正交实验确定各成分的最优组合。

第46页：发酵培养基设计与优化（过渡页）

发酵培养基·发酵培养基的设计和优化：本节内容分隔页。

第47页：改进后培养基的发酵结果

改进后培养基与原培养基的发酵结果对比：改进后培养基的发酵结果优于原培养基。

第48页：摇瓶与反应器两个层次

四、摇瓶水平到反应器水平的优化配方：摇瓶、反应器是培养基研究的两个层次。

• 摇瓶——培养基设计的第一步
• 反应器——最终的优化的基础配方

第49页：青霉素发酵配方差异

例：青霉素发酵

• 发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH₄)SO₄ 0.8%，轻质碳酸钙1%
• 发酵罐：葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%，补加硫酸、前体等

摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大。

第50页：摇瓶优化配方的作用

摇瓶优化配方：菌种筛选、反应器研究的基础。

第51页：发酵罐水平的基础配方

发酵罐：反应器水平，可以得出最终优化的基础配方。

第52页：pH控制摇床

pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究，可在摇瓶条件下实现pH的在线控制。

第53页：pH控制摇床在1,3-丙二醇发酵中的应用

pH控制摇床在1,3-丙二醇发酵中的应用：以pH控制摇床考察pH对甘油消耗与产物生成的影响。

第54页：1,3-丙二醇的用途

1,3-丙二醇的用途

• 最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二醇聚合生产聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)
• 可作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂等，用于食品、化妆品和制药等工业

第55页：PTT纤维性能对比

PTT的性能：与Spandex（Lycra）莱卡氨纶、Acrylic亚克力、Nylon尼龙锦纶、PET涤纶相比，PTT在柔韧度、弹性、丰满度、磨损、抗污染力、洗涤牢度、日晒牢度、抗静电力、色彩密度与成本等指标上综合表现最优，被誉为目前性能最好的纤维、21世纪的大型纤维。

说明：原页为多纤维多指标的性能对照表，源文件文字与评分符号严重粘连，无法安全切分为列对齐的表格，此处按原页结论作文字概述，建议对照原课件图片核对后补充为表格。

第56页：1,3-丙二醇两步发酵法

1,3-丙二醇两步发酵法：糖→（酵母）→甘油→（伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等）→1,3-丙二醇。

第57页：伯氏肺炎杆菌代谢途径

伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇的代谢：甘油→三羟基丙醛→1,3-丙二醇；另一分支经二羟丙酮进入丙酮酸，生成乙酸、乙醇、乳酸、丁醇、丁酸、丁二醇等。

厌氧过程伴随pH下降。

第58页：不同pH对甘油消耗的影响

不同pH条件对甘油消耗的影响：图示不同pH条件下甘油消耗曲线，用以确定适宜的pH控制策略。

第59页：摇瓶分批培养结果

摇瓶培养基分批培养过程结果：分批培养条件下1,3-丙二醇的生成与甘油消耗过程曲线。

第60页：补料培养结果

补料培养过程：甘油浓度为3.43%，对甘油转化率为19%。

第61页：优化培养基后的结果

进一步优化培养基后过程：1,3-丙二醇的浓度5.37%，转化率为40%。

第62页：优化条件后的结果

进一步优化条件后：1,3-丙二醇的浓度为6.72%，对甘油转化率为54.7%，生产强度为1.9g/L·h。

第63页：培养基设计注意的相关问题

五、培养基设计时注意的一些相关问题

• 原料及设备的预处理
• 原材料的质量
• 发酵特性的影响：在抗生素发酵生产中往往喜欢所谓的「稀配方」，因为它既降低成本、灭菌容易、且使氧传递容易而有利于目的产物的生物合成；如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补

第64页：灭菌对培养基的要求

灭菌

• 在大规模发酵中应该尽可能采取连续灭菌的操作，保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提
• 为避免营养物质在加热条件下相互作用，可以将营养物质分开消毒
• 有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法，如 Na₂HPO₄+CaCO₃→CaHPO₄+Na₂CO₃

第65页：大肠杆菌高密度培养培养基

第四节、重组产品培养基的介绍 大肠杆菌高密度培养

• 碳源：葡萄糖、甘油
• 氮源：胰蛋白胨、酵母粉
• 无机盐：磷、镁等

第66页：蛋白胨与酵母粉比较

蛋白胨、酵母粉(OXOID)对比：不同来源的蛋白胨与酵母粉对重组大肠杆菌高密度培养效果存在差异。

引自章越，《生物工程学报》，2004。

第67页：动物细胞培养基组成

动物细胞培养基

• 基础培养基：F12、DMEM等
• 血清（5-10%）：胎牛(FBS)、小牛(CS)、马(HS)
• 水：超纯水
• 其他：NaHCO₃（CO₂）、抗生素

第68页：本章小结

本章小结

• 培养基——菌体生长所需的营养以及其他必须的条件
• 了解发酵培养基的组成，发酵培养基常用的原料以及其中的基本概念
• 发酵培养基的优化与设计是发酵工程的基本问题，掌握发酵培养基优化与设计的思路、了解其中的方法

第69页：聚类分析的应用导言

发酵培养基聚类分析在红霉素摇瓶培养基无机盐分析中的应用：运用聚类分析考察不同有机氮源带入的无机盐对红霉素效价的影响。

第70页：四种有机氮源配方

发酵培养基中的有机氮源

• A：黄豆饼粉 3%
• B：棉籽饼粉 2.37%
• C：酵母粉 2.74%
• D：玉米浆（固体）2.8%

第71页：A—N共14种氮源组合

设计了A—N种氮源组合（蛋白质含量相同）

• A：黄豆饼粉3%
• B：黄豆饼粉1.5%+棉籽饼粉1.18%
• C：黄豆饼粉1.5%+酵母抽提液0.96%
• D：黄豆饼粉1.5%+蛋白胨（进口）0.78%
• E：酵母粉2.74%
• F：棉籽饼粉2.37%
• G：蛋白胨（国产）1.47%
• H：蛋白胨（进口）1.57%
• I：酵母抽提液1.91%
• J：棉籽饼粉1.18%+酵母粉1.37%
• K：棉籽饼粉1.18%+蛋白胨（国产）0.74%
• L：棉籽饼粉1.18%+蛋白胨（进口）0.78%
• M：酵母粉1.37%+酵母抽提液0.96%
• N：蛋白胨（国产）0.74%+蛋白胨（进口）0.78%

第72页：不同氮源培养基的无机盐含量与效价

不同有机氮源培养基中无机盐含量及对应红霉素效价：本页对照A—N共十四种氮源组合的磷、铜、铁、锌、镁、钾含量与红霉素效价（µg/ml），用于分析无机盐水平对效价的影响。

说明：原页为多列数据表，源文件数字严重粘连（如效价与六种无机盐数值连写），无法安全切分为列对齐的表格，此处按原页意图作文字概述，建议对照原课件图片核对后补充为表格。

第73页：聚类分析与T检验方法

本实验运用SPSS软件中的快速聚类分析方法（K-Means Cluster Analysis）对无机盐进行了分析，将各种无机盐含量分成高低两类。根据聚类分析结果可以将各种无机盐高低两个水平下对应的效价分成两类，并用两独立样本T检验分析这两类效价之间是否存在显著差别。

第74页：无机盐聚类分析与T检验结果

无机盐聚类分析结果及T检验结果：钾、镁、锌三行的显著性P值分别为0.841、0.778、0.772，差异不显著；铁、铜两行的P值为0.04与0.042，带*号表示T检验结果存在显著差异。

说明：原页为多行多列数据表（含P值、极差、高低水平平均效价与分组），源文件数字与分组字母严重粘连，无法安全切分为列对齐的表格，此处按原页可读结论作文字概述，建议对照原课件图片核对后补充为表格。

第75页：聚类分析结果的验证

聚类分析结果的验证：通过有针对性的无机盐添加实验，验证聚类分析所得的关键影响因素。

第76页：磷对红霉素效价的影响

磷对红霉素效价的影响

• A：黄豆饼粉 3%
• B：黄豆饼粉 3%+0.01%无机磷
• C：黄豆饼粉 3%+0.02%无机磷

第77页：铜对红霉素效价的影响

铜对红霉素效价的影响

• A：蛋白胨（进口）1.57%
• B：蛋白胨（进口）1.57%+0.035mg%无机铜
• C：蛋白胨（国产）0.74%+蛋白胨（进口）0.78%
• D：蛋白胨（国产）0.74%+蛋白胨（进口）0.78%+0.035mg%无机铜

第78页：磷与铜影响的结论

通过以上铜和磷的添加实验，证实磷含量的变化对红霉素效价确实存在显著影响，而铜含量的变化对效价并无显著影响。可见聚类分析的结果虽不是百分之百正确，但对实践还是有较高的指导作用，通过它很快找到了影响红霉素效价的关键因素。