第1页：第五章 发酵工业的种子制备
第五章 发酵工业的种子制备
第2页：本章内容提要
本章内容
- 种子制备原理与技术
- 影响种子质量的因素
- 种子质量的控制措施
- 种子制备的放大原理与技术
第3页：优良种子应具备的条件
种子制备原理与技术：优良种子应具备的条件
- 生长活力强，延迟期短
- 生理状态稳定
- 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求
- 无杂菌污染，保证纯种发酵
- 适应性强，生产能力稳定
第4页：种子罐级数的确定
- 种子扩大的级数
- 制备种子需逐级扩大培养的次数。
级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。
第5页：种子罐级数的确定方法
确定方法
- 菌种的性质（如菌种传代后的稳定性）
- 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度
- 发酵罐中种子培养液的最低接种量
- 种子罐与发酵罐的容积比
- 生产规模随工艺条件的改变作适当的调整
第6页：种子质量的判断方法
种子质量的判断方法
- 通常检测的培养液中参数：pH是否在种子要求的范围之内；糖、氨基氮、磷酸盐的含量；菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观；有无杂菌污染
- 其他参数：接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等
第7页：种子制备的步骤
种子制备的步骤
- 斜面培养基中活化
- 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备
- 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备
- 种子转种至发酵罐
第8页：种子制备的两个阶段
种子制备过程
- 实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养
- 生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养
第9页：
第10页：实验室种子制备
实验室种子制备：以无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶。
- 菌种产孢子能力强及孢子萌发、生长繁殖迅速，可用固体培养基培养孢子
- 菌种产孢子能力不强或孢子萌发慢，可用摇瓶液体培养法
- 不产孢子的菌种，在保藏基础上于一定温度下活化即可
第11页：种子扩大培养的方法
种子扩大培养阶段
- 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养
- 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养
- 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养
第12页：生产车间种子制备
生产车间种子制备：实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。
- 种子罐培养一获得足够的菌种数量
- 二使种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵环境
第13页：种子罐级数的权衡
- 种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动
- 但要考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求
第14页：种龄
- 接种龄（种龄）
- 种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。
第15页：大量接入成熟菌种的优点
大量地接入培养成熟的菌种的优点
- 缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率
- 节约发酵培养的动力消耗
- 有利于减少染菌机会
第16页：接种龄对多糖产量的影响
放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响：图示不同接种龄下多糖产量的变化曲线，用以确定适宜的接种龄。
第17页：接种量
- 接种量
- 移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例。
- 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足
- 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌
- 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据，接种量的大小直接影响发酵周期
第18页：接种量对多糖产量的影响
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响：图示不同接种量下多糖产量的变化曲线，用以确定适宜的接种量。
第19页：影响种子质量的因素
影响种子质量的因素
- 原材料质量
- 培养温度
- 湿度
- 通气与搅拌
- 斜面冷藏时间
- 培养基
- pH
第20页：原材料质量
原材料质量：原材料质量波动引起种子质量不稳定。
原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素Mg²⁺、Cu²⁺、Ba²⁺能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。
第21页：培养温度
培养温度：温度过低，菌种生长发育缓慢；温度过高会使菌丝过早自溶。
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢、氨基氮回升提前、菌丝过早自溶、效价降低等现象。
第22页：湿度
湿度：湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。
第23页：通气与搅拌
通气与搅拌
- 足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量
- 搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖；过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗
- 丝状微生物不宜剧烈搅拌
第24页：斜面冷藏时间
斜面冷藏时间：对孢子的生产能力有较大影响，冷藏时间越长，生产能力下降越多。
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％，比冷藏3个月的降低35％。
第25页：培养种子的目的
培养基——培养种子的目的
- 扩大培养，增加细胞数量
- 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞，使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长
第26页：种子培养基的特点
种子培养基特点
- 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大
- 各种营养物质的浓度不必太高
- 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源
- 应考虑与发酵培养基的主要成分相近
第27页：pH
pH
- 选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量
- 培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境
第28页：种子质量的控制措施
种子质量的控制措施
- 菌种稳定性的检查：测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮
- 提供适宜的生长环境
- 种子无杂菌检查，保证纯种发酵
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等。
第29页：细菌发酵的种子扩大培养
种子制备的放大原理与技术
- 细菌发酵时的种子扩大培养：主要目的是为了获得大量的活力强的种子
- 种龄对于生芽孢的种子尤其重要，若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
第30页：丁醇丙酮发酵种子程序
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序举例：图示从斜面到各级种子罐的扩大培养程序。
第31页：酿酒酵母的扩大培养
酵母发酵时的种子扩大培养——酿酒酵母的扩大培养
- 最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，将每一步的接种量规定为10％，并控制繁殖条件与酿造时一致
- 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的条件也与酿造时不同
第32页：面包酵母种子扩大程序
面包酵母时的种子扩大培养的程序：图示面包酵母生产中由实验室到生产车间的逐级扩大培养流程。
第33页：丝状真菌的接种物
丝状真菌发酵的种子扩大培养：丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵。
第34页：利用孢子作为接种物
利用孢子作为接种物
- 在固化的培养基上产生孢子
- 「滚瓶」技术应用于产黄青霉的孢子生产
- 在固体培养基上产生孢子
- 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子
- 在液体深层培养基中产生孢子
灰黄霉素产生菌展青霉的试验表明：在良好的通气条件下，培养基中含氮在0.05～0.1％（w/v）之间时可以产生大量的孢子。
第35页：菌丝体作为接种物
丝状真菌的菌丝体作为接种物
- 不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉
- 问题：难以获得均一的接种物
- 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点
第36页：放线菌发酵的种子扩大培养
放线菌发酵时的种子扩大培养
- 斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子
- 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
