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09 第四章 生物工业菌种与种子的扩大培养.ppt

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本课件介绍工业生产常用的细菌、酵母菌、霉菌与放线菌及其对菌种的要求,分析菌种衰退的原因与复壮保藏方法,系统讲解自然选育、诱变育种与理性化筛选,并说明杂交育种、原生质体融合、DNA重组与种子扩大培养。

第四章封面,概括工业微生物要求、菌种衰退复壮保藏、选育改良与种子扩大培养五节
第四章目录页一,列出工业生产常用微生物及要求与菌种衰退复壮保藏两节
第四章目录页二,列出菌种选育、生产菌种改良与种子扩大培养三节
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第1页:第四章生物工业菌种与种子的扩大培养封面

第四章生物工业菌种与种子的扩大培养微生物与发酵工艺

第2页:第四章章节目录(一)

第四章生物工业菌种与种子的扩大培养第一节工业生产常用的微生物及要求第二节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏

第3页:第四章章节目录(二)

第四章生物工业菌种与种子的扩大培养第三节工业微生物菌种的选育第四节生产菌种的改良第五节种子的扩大培养

第4页:工业生产常用的细菌

  • 第一节工业生产常用的微生物及要求
  • 一、工业生产常用的微生物
  • ⒈细菌
  • 工业生产常用的细菌有:枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
  • 用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等等。

第5页:

第6页:工业生产常用的酵母菌

  • ⒉酵母菌
  • 工业上用的酵母菌有:啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
  • 分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶(lipase)以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。

第7页:酿酒酵母与大肠杆菌菌落

酿酒酵母的菌落大肠杆菌的菌落

第8页:工业生产常用的霉菌

  • ⒊霉菌
  • 工业上常用的霉菌有:藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉,子囊菌纲的红曲霉,半知菌类的曲霉、青霉等。它们可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素(steroidhormone)等。

第9页:

第10页:工业生产常用的放线菌

  • ⒋放线菌
  • 在液体浸没培养中由于搅拌器的剪切应力作用,常常形成短的分支旺盛的菌丝体,或呈分散生长,或呈菌丝团状生长。

第11页:放线菌与抗生素生产

  • 放线菌的最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotic)。
  • 从微生物中发现的抗生素,有60%以上是放线菌产生的,如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。
  • 常用的放线菌主要来自以下几个属:链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。

第12页:担子菌与藻类

  • ⒌担子菌
  • ⒍藻类螺旋藻灵芝

第13页:微生物工业对菌种的要求

  • 二、微生物工业对菌种的要求
  • ⑴原料廉价、生长迅速、目的产物产量高;
  • ⑵易于控制培养条件,酶活性高,发酵周期较短;
  • ⑶抗杂菌和噬菌体的能力强;
  • ⑷菌种遗传性能稳定,不易变异和退化,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,保证安全生产。

第14页:菌种衰退的原因

  • 第二节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏
  • 一、微生物菌种的衰退
  • ⒈菌种衰退的原因
  • 菌种衰退的原因有两个方面:
  • 一是菌种保藏不妥;
  • 二是菌种生长的条件要求没有得到满足,或是遇到不利的条件,或是失去某些需要的条件。

第15页:自发突变与回复突变概率

  • 此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变,从而丧失新的特征等情况。
  • 菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。
  • 微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8~10-9,保藏在0~4 ℃时这一突变概率更小,但仍然不能排除菌种衰退的可能。

第16页:回复突变的定义

菌种的回复突变
突变菌株因遗传组成的自身修复,使原有的遗传障碍解除,代谢途径发生变化,从而恢复原有的特性,表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。

第17页:突变不完全造成的差异

突变不完全造成菌体遗传组成的差异。

第18页:菌种遗传特性的改变

  • ⒉菌种性能的改变
  • ⑴菌种遗传特性的改变
  • ①异核现象导致微生物群体发生变异。
  • ②自发突变导致菌种遗传特性改变。
  • ③突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定,容易发生回复突变或产生分离子,以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型(亦称遗传型)的个体。
  • 比较:基因型和表现型

第19页:菌种生理状况的改变

  • ⑵菌种生理状况的改变
  • ①一个菌种不是纯的群体,而是由一些变异株混合组成,这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。
  • 如灰色链霉菌(Streptomyces griseus)链霉菌属孢子丝的主要类型链霉素分子式

第20页:防止菌种衰退的措施

  • ②菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。
  • ③在某些培养条件下,菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态,而使菌种的生理状态改变。
  • ⒊防止菌种衰退的措施
  • ⑴菌种的分离
  • 如芽孢杆菌
  • 如AT3.942栖土曲霉黑曲霉

第21页:菌种复壮与环境控制

  • ⑵菌种的复壮
  • 狭义的复壮与广义的复壮
  • 比较:正突变和负突变
  • ⑶提供良好的环境条件
  • 发酵生产上一般只用三代内的菌种
  • ⑷用优良的保藏方法
  • ⑸定期纯化菌种

第22页:菌种的复壮方法

  • 二、菌种的复壮
  • ⑴纯种分离
  • 菌落纯
  • 细胞纯
  • ⑵通过寄主体进行复壮
  • 如杀螟杆菌
  • ⑶淘汰已衰退的个体
  • 如“5406”菌种

第23页:菌种的保藏方法

  • 三、菌种的保藏
  • ⒈菌种保藏的原理
  • ⒉菌种保藏方法
  • ⑴斜面低温保藏法
  • ⑵液体石蜡封存保藏法
  • ⑶固体曲保藏法
  • ⑷砂土管保藏法
  • ⑸冷冻干燥法
  • ⑹液氮超低温保藏法中温大曲液氮保藏菌种

第24页:简易冷冻干燥法

简易冷冻干燥法

第25页:低温冰箱与液氮罐

低温冰箱液氮罐

第26页:菌种保藏的注意事项

  • ⒊菌种保藏的注意事项
  • ⑴菌种在保藏前所处的状态
  • ⑵菌种保藏所用的基质
  • 低温保藏斜面培养基,碳源比例应少些,营养成分贫乏些较好,否则易产生酸,或使代谢活动增强,影响保藏时间。
  • ⑶操作过程对细胞结构的损害
  • 冻结速度
  • 真空干燥程度

第27页:菌种选育的方法体系

第三节工业微生物菌种的选育菌种选育经验育种定向育种自然选育诱变育种杂交育种分子育种主要通过突变和筛选来育种常规的杂交育种原生质体融合通过DNA重组技术来育种

第28页:自然选育与纯种分离

  • 稀释法
  • 一、自然选育
  • ⒈从自然界分离获得菌株
  • ⑴采样
  • ⑵增殖培养
  • ⑶纯种分离
  • ⑷生产性能的测定划线法

第29页:从自发突变体中获得菌株

  • ⒉从自发突变体中获得菌株
  • 自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。
  • 微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质,优先进行生长和繁殖,而生产菌种(突变株)常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株,因此常常表现出生活力比野生菌株弱、遗传特性不够稳定的特点。

第30页:诱变育种的程序

  • 二、诱变育种的程序
  • 比较:野生菌株与突变菌株
  • 比较:负变异株与正变异株
  • ⒈出发菌株的选择
  • ⒉菌悬液的制备
  • ⒊前培养
  • ⒋诱变
  • ⒌变异菌株的分离和筛选青霉

第31页:诱变过程与亮氨酸产量

下表比较不同诱变菌株在三种发酵方式下的L-亮氨酸产量。

诱变菌株与发酵方式对L-亮氨酸产量的影响
菌株分批发酵(恒温28℃)补料分批发酵(恒温28℃)补料分批发酵(变温控制)
TQ9806(Rifʳ 300 μg/mL)18.521.322.7
TK0301(Rifʳ 400 μg/mL)21.823.124.3
TK0302(Rifʳ)(源文件未列出)(源文件未列出)(源文件未列出)

产量单位为 g·L⁻¹;源文件中 TK0302 一行仅存菌株名称,产量数值缺失,已留空待补充。

第32页:同步生长的选择法

导致微生物同步生长的选择法

第33页:

第34页:突变的诱发与DNA修复

  • 三、诱变育种方案设计
  • ㈠突变的诱发
  • 诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。
  • ⒈诱变剂接触DNA分子
  • ⒉DNA损伤的修复
  • 光复活作用
  • 切补修复
  • 重组修复
  • SOS修复系统
  • DNA多聚酶的校正作用

第35页:

第36页:

第37页:

第38页:从前突变到突变

⒊从前突变到突变光复活作用修复系统校正差错引起差错切补修复DNA多聚酶校正作用重组修复SOS修复系统不利于突变有利于突变

第39页:从突变到突变表型

  • ⒋从突变到突变表型
  • 突变基因的出现并不等于突变表型的出现,表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。
  • 表型迟延有两种原因:
  • 分离性迟延
  • 生理性迟延
  • 前突变突变突变表型
  • 比较:基因型与表型

第40页:诱变剂的种类及选择

  • ㈡诱变剂的种类及选择
  • ⒈诱变剂
  • 物理诱变剂和化学诱变剂
  • ⒉影响诱变效果的因素
  • ㈢出发菌株的选择
  • ①选择纯种作为出发菌株,借以排除异核体或异质体的影响。
  • ②选择出发菌株,不仅是选产量高的,还应该考虑其他因素。
  • ③选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株,

第41页:筛选方案的制定

  • ㈣筛选的方法
  • ⒈制定筛选方案
  • 整个流程可分为诱变和筛选两部分。
  • 筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。
  • ⒉营养缺陷型的筛选方法
  • 比较:营养缺陷型(auxotroph)、原养型(prototroph)、野生型(wild type)
  • 比较:基本培养基(MM)、完全培养基(CM)、补充培养基(SM)

第42页:二次诱变与突变菌株

回复突变株负(正)变株、营养缺陷型等二次诱变突变菌株

第43页:黄色短杆菌的代谢途径

  • 天冬氨酸黄色短杆菌的代谢过程甲硫氨酸苏氨酸赖氨酸中间产物
  • Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物
  • Ⅱ抑制高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶

第44页:人工控制代谢生产赖氨酸

  • 天冬氨酸人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸中间产物
  • Ⅰ天冬氨酸激酶中间产物
  • Ⅱ甲硫氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶不能合成可以大量积累赖氨酸人工诱变的菌种不能产生

第45页:营养缺陷型的筛选步骤

营养缺陷型的筛选,一般是经诱变后,再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。甲硫氨酸缺陷型菌株

第46页:夹层平板法

夹层平板法

第47页:

第48页:突变株的筛选与透明圈

⒊突变株的筛选透明圈

第49页:随机筛选与摇瓶筛选法

  • 育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。
  • ⑴随机筛选
  • ①摇瓶筛选法

第50页:琼脂块筛选法与微型化

  • ②琼脂块筛选法
  • ③筛选自动化和筛选工具微型化

第51页:理性化筛选

  • ⑵理性化筛选
  • 初级代谢产物高产菌株的筛选
  • 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选
  • ①初级代谢产物高产菌株的筛选
  • Ⅰ降低终产物浓度
  • (a)筛选终产物营养缺陷型

第52页:反馈抑制模式图

反馈抑制模式图

第53页:发酵产物的限量供给

CDB反馈阻遏AE反馈抑制abcd发酵产物限量供给

第54页:

第55页:赖氨酸高产菌株的代谢调控

赖氨酸高产菌株的代谢调控机制

第56页:细胞膜透性突变株与抗反馈突变株

  • (b)筛选细胞膜透性改变的突变株
  • 如用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型(biotin deficiency)进行谷氨酸发酵
  • Ⅱ筛选抗反馈突变菌株
  • (a)筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株
  • 如选育L-精氨酸(L-Arg)高产菌株,可采用筛选结构类似物D-Argr菌株的方法
  • 一般文献中采用上标“r”

第57页:

第58页:

第59页:利用回复突变筛选抗反馈突变株

(b)利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

第60页:菌株与培养基生长对照表

不同类型菌株在基本、完全与补充培养基上的生长情况对照如下。

菌株类型与能够生长的培养基对照表
菌株类型遗传事件能够生长的培养基
野生型菌株—MM或CM
营养缺陷型菌株突变SM或CM
原养型菌株回复突变或基因重组MM或CM

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第61页:次级代谢产物高产菌株的筛选

  • ②次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选。
  • 质粒产物
  • 分叉中间体
  • (a)利用营养缺陷型筛选
  • 渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型
  • 一般文献中采用上标“-”表示营养缺陷型,上标“L”表示渗漏缺陷型
  • 例如:Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和苏氨酸渗漏

第62页:

第63页:芳香族氨基酸缺陷型与氯霉素

莽草酸芳香族氨基酸氯霉素分叉中间体反馈调节芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素

第64页:负变株回复突变与去磷酸盐调节

  • (b)筛选负变株的回复突变株
  • (c)筛选去磷酸盐调节突变株抑菌圈

第65页:去碳源分解代谢调节突变株

  • (d)筛选去碳源分解代谢调节突变株。
  • “葡萄糖效应”
  • 葡萄糖的(毒性)结构类似物也可用于筛选去碳源分解代谢调节突变株

第66页:氨基酸结构类似物抗性突变株

(e)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。α-氨基己二酸赖氨酸青霉素分叉中间体反馈调节筛选赖氨酸结构类似物抗性突变株,可以促进青霉素合成

第67页:其他抗性突变株与突变基因表现

  • (f)筛选二价金属离子抗性突变株
  • (g)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株
  • (h)筛选自身所产的抗生素抗性突变株
  • ㈤突变基因的表现
  • 菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件
  • 例如,诱变处理四环素产生菌得到的突变株

第68页:常规的杂交育种

  • 第四节生产菌种的改良
  • 一、常规的杂交育种
  • 青霉菌的杂交过程实际上也是青霉菌准性生殖的过程

第69页:准性生殖过程

菌丝联结异核体杂合二倍体亲本型分离子重组型分离子质配核配染色体交换单倍化

第70页:原生质体融合

  • 二、原生质体融合
  • 原生质体融合一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌株的筛选等。

第71页:

第72页:原生质体融合的主要试剂

主要试剂:脱壁酶、聚乙二醇(PEG)和Ca2+

第73页:原生质体的制备要点

  • 原生质体融合过程简介如下:
  • ⒈标记菌株的筛选
  • ⒉原生质体的制备
  • ⑴菌体的预处理
  • ⑵菌体的培养时间
  • ⑶酶浓度
  • ⑷酶解温度
  • ⑸酶解时间
  • ⑹渗透压稳定剂

第74页:原生质体的融合与再生

  • ⒊原生质体的融合与再生
  • ⒋融合子的选择
  • ⒌灭活原生质体融合技术在育种中的应用
  • ⑴单一亲株灭活
  • ⑵双亲株或多亲株灭活

第75页:DNA重组技术

  • 三、DNA重组技术
  • ㈠DNA重组过程
  • 重组DNA技术一般包括四步,即目标DNA片段的获得、与载体DNA分子的连接、重组DNA分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组DNA分子的宿主细胞。
  • 作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。
  • ㈡分子育种技术
  • 通过基因工程改造后的菌株称为工程菌

第76页:基因工程生产氨基酸

利用基因工程技术生产氨基酸

第77页:种子扩大培养的任务与过程

  • 第五节种子的扩大培养
  • 一、种子扩大培养的任务
  • 二、种子制备的过程
  • ⒈孢子制备
  • ⑴放线菌孢子的制备
  • 菌种进入种子罐有两种方法:
  • 孢子进罐法
  • 摇瓶菌丝进罐法搅拌种子罐

第78页:孢子制备与种子制备

  • ⑵霉菌孢子的制备
  • ⒉种子制备
  • ⑴摇瓶种子制备
  • ⑵种子罐种子制备
  • 比较:种子制备的目的和发酵的目的

第79页:种子罐级数的确定

  • 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。
  • 种子罐级数减少,有利于生产过程的简化及发酵过程的控制,可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。

第80页:酵母菌的三级培养过程

酵母菌的三级培养过程

第81页:种子培养的方法

  • 三、种子培养
  • ⒈表面培养法
  • ⒉固体培养法
  • ⒊液体深层培养

第82页:影响孢子质量的因素

  • 四、种子质量的控制
  • ㈠影响孢子质量的因素及其控制
  • ⒈培养基
  • ⒉培养温度和湿度
  • 例如:龟裂链霉菌斜面
  • ⒊培养时间和冷藏时间
  • ⑴孢子的培养时间
  • ⑵孢子的冷藏时间
  • ⒋接种量

第83页:影响种子质量的因素与种龄

  • ㈡影响种子质量的因素及其控制
  • ⒈培养基
  • ⒉培养条件
  • ⒊种龄
  • 在工业发酵生产中,一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期,菌体量尚未达到最高峰时移种。
  • ⒋接种量
  • 双种法;倒种法;混种法

第84页:黄色短杆菌菌体形态变化

分批发酵条件下,黄色短杆菌TK0303的菌体形态变化5L罐延迟期(4h)5L罐对数期(32h)5L罐稳定期(48h)5L罐衰亡期(68h)摇瓶衰亡期(72h)

第85页:种子质量标准与异常分析

  • ⒌种子质量标准
  • ⑴细胞或菌体
  • ⑵生化指标
  • ⑶产物生成量
  • ⑷酶活力
  • ⒍种子异常的分析
  • ⑴菌种生长发育缓慢或过快
  • ⑵菌丝结团
  • ⑶菌丝粘壁放线菌

第86页:菌丝团与霉菌菌丝

菌丝团霉菌菌丝

第87页:本章思考题(一)

  • 思考题
  • ⒈微生物有哪些特点?试举例说明微生物的工业应用。
  • ⒉工业生产中使用的微生物菌种为什么会发生衰退?菌种衰退表现在哪些方面?防止菌种衰退的措施有哪些?

第88页:本章思考题(二)

  • 思考题
  • ⒊简要说明诱变育种的步骤。诱变育种应注意哪些问题?
  • ⒋试比较诱变育种技术、原生质体融合技术、DNA重组技术三种育种方法的优缺点。
  • ⒌影响种子质量的因素有哪些?如何控制种子质量?

第89页:

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