页数：76页文件大小：17.23 MB来源： 发酵工艺学ppt课件
本课件讲解生物工业菌种的来源与工业常用微生物类群，分析菌种衰退原因与复壮保藏方法，并系统介绍自然选育、诱变育种、杂交育种与种子扩大培养的工艺流程。
工业生产常用的微生物
微生物资源的开发潜力：由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。
尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。
微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；
微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。
在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。
细菌的形态与繁殖：细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物（unicellular prokaryote），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。
细胞生长时，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。
尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。
微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；
微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。。在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。。环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。
常用工业细菌及产品：工业生产常用的细菌有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌(Lactobacillus lactics)醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌(Brevibacterium)用于生产：生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lactic acid)醋酸(acetic acid)氨基酸(amino acid)肌苷酸(inosinic acid)
酵母菌的特征与应用：酵母菌（yeast）酵母菌为单细胞真核生物（unicellulareukaryote），在自然界中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。
石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围的土壤中。
酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。
母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的母细胞。
如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。。工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。
真核细胞结构示意图：真核细胞结构示意图
霉菌的特征：霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌。
霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。
它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。
霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。
工业常用霉菌及产品：生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。
菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。
菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；
产品：酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone）等。
放线菌的特征：放线菌(Actinomycetes)放线菌因菌落呈防线状而得名。
它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。
大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。
后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultures）中。
其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。
放线菌与抗生素：在液体沉没培养中由于搅拌器（agitator）的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。
它的最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）。
从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。
常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。
担子菌与香菇抗癌：其他生物：A: 担子菌（Basidiomycetes）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。
担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发。
近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。
病毒的特点：B：病毒(virus) 其特点如下：形体微小，体积比细菌小的多。
没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。
营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。
人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus ，HIV ）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）
噬菌体与增殖过程：噬菌体（phage）是病毒的一种。Ｑ：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。
噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。
藻类资源与能源化：C：藻类（alga）：培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；
从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。
此外，还可通过藻类将CO２转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。
有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻暗5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。
此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO２造成的温室效应。。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。
工业生产对菌种的要求
菌种筛选的六项指标
在筛选所需的菌种时应考滤的一些重要的指标：
菌种衰退的原因：第二节菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种衰退的原因1. 原因一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件；
三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况。
连续传代使菌种退化的直接原因，由于菌种经常处于旺盛的生长状态。
衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产能力降低；
代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力降低。
菌种性能的改变
防止菌种衰退的措施：3 防止菌种衰退的措施菌种的分离:。•对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。
如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进行分离复壮。
芽孢杆菌与曲霉复壮：如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。
某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。
如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。
同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。
Ｑ：如何分离单细胞菌株（strain）？
富集液体培养法：菌种分离的方法施加选择压力的分离方法：1 、富集液体培养：指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。
要领：给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌群生长的条件。
e.g.供给特殊的基质或加入某些抑制剂。注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其他微生物生长。
解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基中可以重新建立选择压力，重复移植几次后，将富集培养物再接到固体培养基上。
固体培养基分离法：２、固体培养基培养：常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。
e.g. 碱性蛋白酶的分离用不同PH的土壤作为原始种子。
土壤必须经过巴氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在PH为9~10的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面。
碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白，产生一清晰圈。
随机分离方法
抗生素产生菌的筛选：抗生素生产菌的筛选：把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。
也可以将微生物分离株生长在液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。
生长因子产生菌的筛选：通过观察分离菌能否促进营养缺陷型（auxotroph）的生长，便可检出生长因子产生菌。
多糖与药理活性菌筛选：多糖生产菌的筛选：从制糖工业的废水中可获得分离株，在适当的培养基中生长，可从菌落的粘液状外观识别这类产生菌。
药理活性化合物生产菌的筛选：一种化合物如果能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。
若将体外筛选出的活性化合物，再用动物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生产菌。
防衰退与复壮措施：措施•菌种的复壮•提供良好的环境条件•使用优良的保存方法•定期纯化菌种
菌种的复壮途径
菌种保藏的基本原理：三菌种保藏（strain preservation）基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活波状态。
要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。
保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子（spore）、芽孢(gemma)等；
其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动，延长其保存期的目的。
不同菌种的保藏方法：保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。
不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。
也可采用石蜡油封保藏法。霉菌：沙土管保藏法。细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。
放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。保藏应注意的问题：菌体状态：休眠体基质：营养贫乏操作过程：不应对细胞造成伤害
微生物育种的基本方法：工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。
就是要改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。
代谢控制育种主要有两个方面：改变代谢通路的育种改变代谢自动调节系统的育种第三节菌种的选育：
自然选育的流程：一、自然选育采样增殖培养从自然界分离菌株纯种分离性能鉴定从自发突变中获得菌株
自然选育逐级分离流程：采样↓增殖培养↓第一次平板分离→第一次原种斜面↓第二次平板分离→第二次原种斜面↓第三次平板分离→第三次原种斜面↓第四次平板分离→第四次原种斜面↓初步工艺条件摸索→复筛种子培养↓较优菌株1－3株保藏及进一步做生产性能试验某些必要试验和或作为育种的出发菌株毒性试验等
诱变育种的程序：二、诱变育种的程序按照生产的要求，根据生物的遗转和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种选育的目的。
诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。
诱变育种操作流程图：原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液自然分离（对照液）活菌计数诱变处理诱变处理预备实验处理液活菌计数平板分离形态变异并计算其变异率斜面培养初筛、复筛自然分离和再复筛保藏及扩大试验诱变育种
诱变育种方案设计
营养缺陷型的筛选：制定筛选方案营养缺陷型的筛选方法中间培养;淘汰野生菌;检出缺陷型菌突变株的筛选随机筛选:摇瓶法;琼脂块法;自动化法理性化筛;初级代谢产物菌的筛选次级代谢产物菌的筛选(见第五章)
杂交育种与原生质体融合：第四节生产菌株的改良杂交育种：两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。
一、常规的杂交育种:不须用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质重新组合。
二、原生质体融合：原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用型菌株的筛选。
原生质体融合的步骤
DNA重组技术流程
三、DNA重组技术
种子扩大培养的任务
实验室种子的制备：二、种子制备过程实验室种子的制备（孢子培养）生产车间种子制备（种子培养）1、实验室种子的制备：产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种斜面试管获得孢子250ml 茄子瓶（大米或小米）25 ~28°C ，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）。转
菌丝体种子制备
细菌斜面营养细胞保藏：不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞保藏法，2-3个月一种一次，进而再进行扩培。
谷氨酸菌与酵母扩培实例：e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）小三角瓶培养（摇床）(flask culture) 大三角瓶培养（摇床）e.g. yeast：原始菌种（出发菌种）10ml 麦汁试管250ml 三角瓶培养（25 °C ~27 °C ，3天）（25°C，2天）5~10 卡氏罐（15 °C ~20 °C ，3~5天）
种子罐级数的确定：2、生产车间种子制备：种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。
依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以及所用的发酵罐的容积。
种子罐(seeding tank)的级数产物的品种生产规模工艺条件
种子扩培的级数对比：种子罐级数越少越好，取决于种子性质、生长速度、发酵设备。
级数少则简化生产工艺和控制，减少接种带来的染菌机会。
一级种子扩培实验室种子种子罐发酵罐二级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐发酵罐三级种子扩培实验室种子一级种子罐二级种子罐三级种子罐发酵罐（例灰色链霉菌）返
酒母扩大培养过程：•酒母扩大过程试管菌株液体试管小三角瓶大三角瓶卡氏罐汉森罐酒母繁殖槽发酵罐
静置与通气培养类型：三、工业微生物培养的类型静置培养法通气培养法1 、表面培养法：是一种好氧静置培养法。
针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。
固体与液体深层培养：2、固体培养（发酵）法：固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。
3.液体深层培养（发酵）法液体曲、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸及其他发酵产品先后采用此法进行生产。
特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
深层发酵的控制要点：深层发酵基本操作的3个主要控制点A 灭菌B 温度控制C 通气、搅拌搅拌的目增加溶解氧；
使基质混合均匀；促进热传递。
两步法液体深层发酵：现将几种深层培养（发酵）法介绍如下：两步法：在酶制剂、氨基酸生产方面应用为了取得最大的高活力酶，必须制定一种调节方法，既要求细胞的单位酶活力高，又要求细胞数量多，也就是说，给菌体在各种生理时期创造不同的条件。
两步法的特点：两步法的特点:菌体生长条件（营养期）与产酶条件（繁殖期）区分开来。
在氨基酸两步法液体深层发酵中，分繁殖期产物生成期(繁殖、变形、产酸）在抗生素生产中分生长期和生成期
载体培养法：载体培养法：特征：以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只要将菌体和培养基挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔材料既有足够的表面积，有能允许空气流通。
控制培养法与计算机发酵：控制培养法：根据发酵罐内部的变化情况，掌握暂短时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。
为此，用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境（培养条件）控制于给定的基准内。
这就叫做电子计算机控制发酵。目前已有大量用于露天大罐啤酒发酵。
影响孢子质量的因素
大接种量的作用与风险：原因：1、种子多，种子液中含有大量的体外水解酶，有利于对基质的利用２、生产菌迅速被占据了整个培养环境，减少染菌机会。
但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。
双种法与倒种法：趋势：采取大接种量及丰富培养基。如谷氨酸：大接种量20% ，高生物素。
有的采用双种法：两只种子罐一只发酵罐如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高8%，到达产量高峰的时间提前。
倒种法：以适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。
如链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。
原材料对种子质量的影响：（二）影响种子质量的因素原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。
原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg++、Ca ++、Ba++能刺激孢子的形成。
P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。
培养条件对孢子的影响：培养条件：温度、PH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。
培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。
种龄与接种量：种龄与接种量：种龄(seed age)指种子罐中培养的种子开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。
过老：生产能力下降，菌体自溶。过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。
菌种稳定性的检查：种子质量的控制措施必须保证生产菌种的稳定性提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入菌种稳定性的检查：少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。
挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。
种子的无菌检查：无菌检查：显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。
种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。
种子质量的感官判断：•种子质量的判断：考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。
感官判断：看颜色、闻气味
种子质量的理化指标
理化指标测定：
第二章重点掌握内容
章节重点
第二章思考题
常用的六大微生物有哪些？
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