页数：131页文件大小：3.31 MB来源： 发酵工程ppt课件
本课件讲解发酵工程灭菌技术，先区分灭菌、消毒、防腐与化疗，再展开湿热灭菌原理、对数残存定律与比热死亡速率常数，最后给出分批与连续灭菌的工程计算及空气除菌流程。
第四章 发酵工程灭菌技术
本章学习要点
教学要求：掌握培养基和设备灭菌的意义和方法；分批灭菌和连续灭菌的优缺点比较；培养基灭菌的工程设计、培养基与设备、管道灭菌条件。
第一节 培养基灭菌 一、概述
微生物的培养过程：培养基配制→灭菌→接种→培养。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。灭菌的目的：纯种发酵。
用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂，最重要的如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。
为什么要进行培养基灭菌？生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，容易受到杂菌污染，杂菌的存在会造成以下不良后果。
工业上具体措施包括
培养基灭菌的目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。
（二）灭菌的方法
工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌，湿热灭菌简便、有效、经济。
1.化学药物灭菌：利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌。
说明：原文「0.%~0.25%KMnO₄溶液」百分号前数值缺失，按常用浓度区间补为0.1%~0.25%，建议对照原课件核对。
2.电磁波、射线灭菌：利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌，包括紫外线、阴极射线、X射线、γ射线。
3.加热灭菌——高温致死原理：高温使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。
每一种微生物都有一定的最适生长温度范围：处于最低温度以下时代谢作用几乎停止而处于休眠状态；温度超过最高限度时，细胞中的原生质胶体和酶发生不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。
本页源文件仅提取到「连」字，疑为「连续灭菌」标题的残片，对应后文连续加压灭菌法的内容。
说明：源文件本页文字残缺，建议对照原课件图片补充完整表述。
巴氏灭菌法(pasteurization)，亦称低温消毒法、冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。
巴斯德受人邀请研究啤酒变酸问题，发现罪魁祸首是乳酸杆菌；他以50~60℃加热啤酒半小时，即可杀死乳酸杆菌和芽孢而不必煮沸，这一方法挽救了法国的酿酒业。
主要原理：在一定温度范围内，温度越低细菌繁殖越慢；温度越高繁殖越快，但温度太高细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。
经巴氏消毒后仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4℃左右保存，且只能保存3~10天，最多16天。
现行方法
目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种
杀菌的基本原则是能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。
主要应用：主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少发生变化。其原理是根据对耐高温性极强的结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异，在低温下长时间或高温下短时间加热处理。
在60℃以下加热30分钟的方式作为低温灭菌的标准早为世界广泛采用；利用高温处理可增强灭菌效果，称为高温灭菌（sterilization），即在95℃以上加热20分钟。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。
通常市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法灭菌，用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。
巴氏消毒法也不是万能的，经其处理的牛奶仍要储存在较低的温度下（一般＜4℃），否则还是有变质的可能性。只要巴氏消毒奶在4℃左右保存，细菌繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。
（1）干热灭菌法：利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌。
（2）湿热灭菌法：利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌。
湿热灭菌要比干热灭菌更有效：a.原生质在含水量高的情况下易变性凝固；b.蒸汽的穿透力强。
湿热灭菌分为分批灭菌与连续灭菌。间歇灭菌法又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法，适用于不耐热培养基：在80～100℃下蒸煮15～60分钟杀死营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜诱导残留芽孢发芽，连续重复3天即可在较低温度下达到彻底灭菌效果。
加压常规加压灭菌法：盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空气后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kg／cm²或15磅／英寸²），时间维持15～20分钟；也可采用在较低温度（115℃，即0.7kg／cm²或10磅／英寸²）下维持35分钟的方法。
此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。
连续加压灭菌法：在发酵行业里也称「连消法」，只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。
主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135～140℃下处理5～15秒钟。
连续加压灭菌法优点
高温对培养基成分的有害影响及其防止：高温灭菌在杀灭杂菌的同时会引起培养基组分的破坏，需采取针对性措施加以防止。
消除高温有害影响的措施
灭菌设备 1、高压蒸汽灭菌：生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多。
立式灭菌锅：立式高压蒸汽灭菌锅的外形与结构示意。
2、常压蒸汽灭菌锅：用铁锅、砖、水泥砌成，造价低，适于一般生产单位和专业户使用，最大的锅每次装料最好不超过500公斤。
3、烘箱：主要用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其他物品烘干。
（三）培养基灭菌的要求：培养基灭菌程度因发酵系统而不同。
培养基灭菌需解决的问题：灭菌的温度、灭菌的时间。
（四）发酵工业培养基灭菌的特点：数量多、含有很多固体物质、有利于生产菌的生长、方便易行、价格便宜。
培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌——湿热灭菌。湿热灭菌的优点：蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。
培养基湿热灭菌需解决的工程问题：将培养基中的杂菌总数N₀杀灭到可以接受的总数N（10⁻³），需要多高的温度、多长的时间为合理。
二、加热灭菌的基本原理
（一）相关概念
（二）培养基灭菌动力学：湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是：既要达到一定的灭菌程度，又要尽量减少营养成分的破坏。
对数残存定律——热死灭动力学方程：杂菌受热被杀死的主要原因是高温使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应。在灭菌过程中活菌逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而递减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比。
热死速度常数（杀菌速度常数）K与菌的种类和加热温度有关（min⁻¹），是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据；K值越小，则此微生物越耐热。
将存活率与灭菌时间t在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。直线的斜率为K，K值越大表示微生物越容易死亡。
三、比热死亡速率常数K 1、微生物的种类对K值的影响：T一定，K随微生物种类不同而不同。
同一种微生物营养细胞和芽孢的K值也有很大差别，营养细胞易于受热死亡，K值很高；120℃灭菌时营养细胞的K值大致为10¹⁰（min⁻¹）数量级，而细菌孢子的K值在120℃只有10⁰数量级。
说明：原文「1010」「100」为排版丢失上标，按发酵工程通行数据补为10¹⁰与10⁰，建议对照原课件核对。
实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同，表现为非对数的死亡动力学，这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。
但当温度超过120℃时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学，即符合一级反应规律。
D与K成反比。
2、温度对K值的影响——Arrhenius方程：K＝Ae^(-ΔE/RT)
ΔE——活化能（J/mol）
对 ln K =－ΔE/RT + ln A 两边求T的导数，可得温度变化率与ΔE的关系：ΔE越大，变化越显著。
细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而大部分营养物质热破坏反应的ΔE很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ln(N/N₀) =－Kt）；由于营养成分热破坏的ΔE很低，温度提高只能稍微增大其热破坏速率，但由于灭菌时间显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。
1、营养成分的保持：培养基成分受热分解的反应也属一级反应，符合对数残存定律：Xₜ/X₀=e^(-Kt)
阿氏方程表述：ln K = ln A—ΔE/RT
通常E比E'大很多。化学反应动力学指出：在活化能大的反应中，反应速率随温度变化也大。故当温度升高时，杂菌死亡速率要比营养成分破坏速度快得多，因此采用HTST（高温短时）方法可以减少营养成分破坏。
灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养的破坏程度。
分批灭菌和连续灭菌的优缺点 1、连续灭菌的优缺点
2、分批灭菌的优缺点
培养基灭菌的工程设计：无菌的标准——根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的，因此在工程设计中常取N=10⁻³。
分批灭菌的设计计算
分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在3～4×10⁵Pa（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。全过程包括升温、保温、降温三个过程。
间歇灭菌的优缺点
保证间歇灭菌成功的要素
附：发酵罐的接管图。
二、基础条件的确定
例如：培养基100m³，含菌10⁵个/ml，要求灭菌后存活菌数10⁻³个/罐，则N₀/N = (100×10⁶×10⁵/10⁻³) = 10¹⁶，为计算方便取ln(N₀/N)=36.8。
分批灭菌过程包括升温、保温和降温，灭菌主要在保温过程中实现，在升温的后期和冷却的初期培养基温度很高，对灭菌也有一定贡献。
4、污染菌的热死特性：要了解是否符合对数残留定律，确定K、A、E的值，对不同细胞选取不同的T和t（基质值的计算、维持时间计算：根据阿氏方程和总基准值计算）。
5、培养罐中温度与时间的关系：大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时间不能忽略。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和，即t=t₁+t₂+t₃。
培养基间歇灭菌过程中应注意的问题
连续灭菌中维持时间的计算注意点
例1：有一发酵罐内装40m³培养基，在121℃温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×10⁵个耐热细菌芽孢，已知121℃时灭菌速度常数k=1.8min⁻¹，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。
由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至100℃以上这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。
例2：某发酵罐内装40m³培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，原污染程度为每1ml含有2×10⁵个杂菌，已知131℃时灭菌速度常数为15min⁻¹，求灭菌所需的维持时间。
二、连续灭菌流程
薄板换热器：连续灭菌中用于培养基预热与冷却的板式换热设备结构示意。
2、直接加热连续灭菌流程：除采用间接加热装置外，还利用蒸汽直接加热。
喷射加热－真空冷却流程：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏少。
附：典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图。
连续灭菌设备的结构：套管式连消加热器、喷嘴式连消加热器。
连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程：培养基经连消塔加热后进入喷淋冷却器降温的连续灭菌流程示意。
维持罐与喷射加热器：连续灭菌系统中用于保证维持时间和快速升温的两类关键设备。
发酵培养基的过滤除菌 一、过滤除菌机理
二、过滤器的类型
深层过滤：滤浆通过过滤介质，微粒被截留在介质内部。
过滤除菌适用于含有热敏性物质的培养基。
除菌要求
第三节 空气除菌
一、空气除菌的意义：好气性微生物的生长和合成代谢产物都需要消耗氧气，工业生产上均采用空气作为氧气来源。然而空气中有各种各样的微生物，为保证纯种培养，必须将空气中的微生物除去或杀死。
二、空气中的微生物：空气中微生物的含量和种类随地区、高低、季节、空气中尘埃多少和人们活动情况而异。
一个通气量为40m³/min的发酵罐，发酵周期为125h，所需要通入的空气量高达3×10⁵m³。
三、好气性发酵对空气无菌度的要求：好气性发酵中需要大量无菌空气，但空气绝对无菌是很难做到的，也是不经济的，只要使在发酵过程中不至于造成染菌而出现「倒罐」现象，这就是通风发酵对无菌空气的要求。
不同类型的发酵，由于菌种生长活力、繁殖速度、培养基成分和pH值及发酵产物等不同，对杂菌抑制的能力不同，因而对无菌空气的无菌程度要求也有所不同。在工程设计上，一般要求1000次使用周期中只允许有一个杂菌通过。
空气除菌的方法（重点）1、热杀菌：将空气加热到一定温度后保温一定时间，使微生物蛋白热失活而致死。热杀菌是有效的、可靠的杀菌方法，但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气以达到杀菌目的，这是十分不经济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。
2、辐射杀菌：高能阴极射线、X射线、γ、β射线、紫外线都能破坏蛋白质活性而起到杀菌作用。
其中紫外线用的较多，它在波长226.5nm-328.7nm时杀菌最强，一般用于无菌室、手术室杀菌。
3、静电除菌：静电除尘法已广泛使用，除尘效率一般在85~99%之间，消耗能量小，每处理1000立方米的空气每小时只需电0.2~0.8kW，空气压头损失小，一般只在4~20mm水柱。
静电除尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除菌除尘的目的。悬浮于空气中的微生物、微生物孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒在进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒；但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除菌对很小的微粒效率很低。
4、过滤除菌
单根纤维过滤除菌的原理：当气流通过滤层时，基于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，把微生物微粒截留、捕集在纤维表面上，实现过滤的目的。
一般认为惯性撞击截留、拦截截留和布朗运动截留的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小。
1、惯性捕集作用：空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动、因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而被滞留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞滞留。
纤维能滞留微粒的宽度区间d与纤维直径df之比称为单纤维的惯性碰撞捕集效率，用η₁表示，即η₁＝d/df。实践证明，η₁是惯性力的无因次准数φ的函数。
滞留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以气流速度愈大，惯性力大，滞留效果也愈好；此外惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。
空气临界速度Vc：η₁=0；φ与纤维直径、颗粒运动速度（气流速度）有关。
2、拦截捕集作用（阻截）：当气流速度降到临界速度以下时，微粒不再由于惯性碰撞而被截留。随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集，这种作用称之为阻拦滞留。
单个纤维对微粒阻拦效率可由微粒和纤维直径之比R、空气密度ρ与雷诺准数Re（Re=dfVρ/μ）表示。空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦滞留作用愈大；但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦滞留并不起主要作用。
3、布朗扩散捕集作用：直径小于1μm的微粒在运动中往往产生一种不规则的布朗运动而与纤维接触且附着于纤维表面而被捕集，且可使微粒间相互凝集成较大的粒子，增加了微粒与纤维的接触滞留机会，从而发生重力沉降或被介质截留。
这种作用只有在气流速度较低时才较显著，可大大增强阻拦截留作用。若微粒位置移动2X₀，则可用2X₀代替dp，计算出由于扩散而导致的微粒阻集效率η₃。
4、重力沉降捕集作用：重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。
就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。
5、静电吸附捕集作用：干空气对非导体的物质相对运动磨擦时会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维尤其是一些合成纤维更为显著。
悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子15%带正电荷、70%带负电荷、15%中性，这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。就纤维过滤器而言，若重力沉降作用和静电吸附不计，则单个纤维的阻集效率η可表示为η＝η₁+η₂+η₃。
六、空气过滤器的设计计算 1、过滤除菌的机制：使空气通经经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒滞留在介质中而达到除菌的目的。
常用的过滤介质一般是棉花、活性炭、超细玻璃纤维、石棉滤纸及烧结材料等。过滤材料孔径一般比细菌大，对细菌的滞留主要靠滞留作用，由多种机制构成：惯性碰撞、阻拦、布朗运动、重力沉降、静电吸引等。
2、深层过滤除菌原理：介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高；对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量有关。
空气过滤时，其中的颗粒数N随着滤床厚度L的增加而减少，其规律可表示为：dN/dL=－KN（K为过滤常数，决定于过滤介质的性质和操作情况，单位cm⁻¹），积分得上式即为对数穿透定律。
过滤常数K与许多因素有关，如空气流速V、纤维直径df、颗粒直径dp和纤维填充密度等，一般经实验求得。
由对数穿透定律可知，K越大，L90就越小。过滤器的效率由过滤除去的颗粒数与最初进来的颗粒数比值决定。
3、深层过滤除菌的计算：L为滤层厚度，由对数穿透定律结合过滤常数K与要求的穿透率求得所需滤层厚度。
例题
解：由对数穿透定律可求得所需滤层厚度L；过滤器的截面积可由空气的体积流速除以气流线速度得到。
空气过滤常用介质：过滤介质是过滤除菌的关键。
过滤对介质的要求：吸附性强，除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染，阻力小，空气流量大，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、化学纤维、超细玻璃纤维、纤维板、石棉滤板等。
1、传统过滤介质
4）超细玻璃纤维纸：高速过滤介质，低速过滤时以拦截扩散为主，当气流速度超过临界速度时属于惯性冲击；过滤效率高，阻力损失小，但机械强度差。
5）石棉滤板：20%纤维小而直的蓝石棉和8%纸浆纤维混合打浆压制而成；过滤效率较低；耐湿，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间较长。
2、新型过滤介质
主要有两类产品：一类是超细硼硅酸纤维滤材经特殊聚四氟乙烯涂层；另一类是采用聚四氟乙烯疏水性滤材的单层膜。
空气过滤除菌设备及流程（重点）1、压缩空气的预处理
1）压缩空气的冷却：压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧；增大发酵罐的降温负荷；增加发酵液水分的蒸发；给培养温度的控制带来困难；影响微生物生长。一般用列管式冷却器进行冷却。
2）除油除水：大气中总含有一定量水分，空气压缩后的绝对含湿量不变，当其冷却时相对湿度增大。
一般用相对湿度在60%的压缩空气进行过滤除菌，不会使过滤器潮湿而影响过滤效果。
2、空气过滤除菌一般流程：由粗过滤器、空气压缩机、贮罐、冷却器、气液分离器与空气过滤器等单元串联组成的典型流程。
1）粗过滤器：安装在空气压缩机前的过滤设备，用于捕集较大的灰尘颗粒、保护空气压缩机。
2）空气贮罐
3）空气冷却器与4）气液分离器
5）空气过滤器：过滤除菌的关键设备。
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、适当加热流程
特点：两次冷却、两次分油水、适当加热。空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却至20～25℃，经分水后加热到30～35℃，因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
特点：省去一级冷却和分离设备及空气再加热设备，简化了流程，使冷却水用量也降低了。压缩空气从贮罐出来分两路，一部分进冷却器，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混合后的空气温度为30～35℃，相对湿度为50～60%。
高效前置过滤除菌流程：在压缩机前设置一台高效过滤器，这样便可降低过滤器负荷（即多次过滤），达到空气除菌的要求。
空气处理实用流程图：汇总高空采风、压缩、冷却、分油水、加热与过滤除菌的完整工程流程。
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