06 实验部分.ppt

第1页：HPLC在中成药检验中的应用

高效液相色谱法在中成药检验中的应用（一）

第2页：学习内容与目的

学习内容和目的1. HPLC的定义、特点和类型2.色谱仪的组成及其工作原理3.药检的一般步骤和方法★★★★★★

第3页：高效液相色谱法的定义

一、概述1.高效液相色谱法（High Performance LiquidChromatography HPLC）系采用高压流动相，高效

第4页：HPLC与LC、GC特点比较

2.HPLC的特点类型特点HPLCLC（经典柱色谱）GC分离效能高（理论板数n）104～10510～102填充柱>103毛细管柱=106分析速度快

第5页：历版药典HPLC应用情况

HPLC特别适合分析组分复杂、含量较低的样品，在中药和中成药的检验中得到广泛的应用。历版中国药典（一部）中HPLC应用情况916992114651810512

说明：原文“历版中国药典（一部）中HPLC应用情况”后接连续数字串 916992114651810512，各版次数据与年份对应关系无法安全切分，此处保留原文，建议对照原课件图表补充。

第6页：HPLC的主要类型

3. HPLC的主要类型及其应用类型机理固定相流动相适用范围反相键合相色谱类似反相分配色谱机理常用十八烷基键合相（C18ODS）常以

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第8页：高效液相色谱仪的组成

二、色谱仪及其工作原理1.贮液罐2.脱气装置3.梯度洗脱4.高压输液泵5.流动相流量显示6.柱前压力表7.输液泵头8.过滤器9.阻尼器10.进样装置11.色谱柱12.检测器13.数据处理系统14.废液贮罐

第9页：脱气装置与脱气方法

超声波脱气法回流脱气法抽滤脱气法（一）脱气装置

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第12页：等度洗脱与梯度洗脱

等度洗脱梯度洗脱梯度洗脱等度洗脱梯度洗脱的效果

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第14页：手动进样器与六通阀

Loadinject1.手动进样器及其进样方法（四）进样装置六通阀

第15页：六通阀进样原理图

六通阀进样原理图loadinject

第16页：自动进样

自动进样：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「2.自动进样（视频）」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第17页：色谱柱的规格

分析型色谱柱各种类型色谱柱

• （五）色谱柱内径：
• 4.6mm长度：15mm、25mm柱填料粒度：5～10μm

说明：原文柱长写作“15mm、25mm”，按分析型色谱柱常规规格应为15cm、25cm，此处保留原文数值，引用时请核对原课件。

第18页：柱温控制

柱温箱（室温～60℃±0.1℃）西洋参中人参皂苷的含测：柱温40 ℃参精止渴丸中葛根素的含测：柱温40 ℃柱温控制

第19页：检测器的类型

灯室流通池（六）检测器紫外检测器（UVD 最常用）、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器（DVD）、蒸发光散射检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）等紫外检测器外观图

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第23页：HPLC操作注意事项

• 操作注意事项：1.流动相需用微孔滤膜（0.45μm）滤过并脱气才可使用。
• 2.开泵后，先打开冲洗键（PURGE）进行泵排气

第24页：HPLC知识自测题

• 1.药品检验大多采用____HPLC。（A.正相键合相B.反相键合相）2.反相键合相HPLC常用____柱（A.C18 B.C8），常以___为流动相（A.甲醇-水B.乙腈-水C.苯）。
• 最有效的脱气方法：是____（A.回流法B.抽滤法C.在线脱气法D.超声波法）。
• 4.洗脱方式有____（A.梯度洗脱B.等度洗脱C.差度洗脱）。
• 5.常用的高压输液泵为____（A.恒压泵B.串联双柱塞恒流泵C.单柱塞恒流泵）。
• 6.进样器有____（A.注射器B.六通阀C.自动进样装置）。
• 7.最常用的检测器为____（A.ELSD B.MS C.DVD D.UVD）。
• （十）小结

第25页：HPLC在中成药检验中的应用（二）

高效液相色谱法在中成药检验中的应用（二）Application of HPLC to Quality ControlofTraditionalChinese Patent Medicine主讲人梁延寿

第26页：药检的一般步骤

三、HPLC在药检中的一般步骤测试溶液制备系统适应性试验数据处理样品测定结果判断

第27页：测试溶液的制备

（一）测试溶液的制备按各品种项下规定制备对照品溶液和供试品溶液。操作应严格规范，定量取

第28页：对照品溶液的制备

对照品溶液的制备：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「1.对照品溶液的制备对照品」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第29页：供试品溶液的制备

2.供试品溶液的制备粉碎（分散）样品精密称定

第30页：样品提取方法

样品提取方法：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「连续回流提取超声波提取水蒸气蒸馏」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第31页：过滤萃取与定容

过滤萃取与定容：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「过滤固液萃取定容液液萃取」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第32页：系统适应性试验

（二）系统适应性试验▲采用药品标准规定的对照品和条件对色谱系统进行试验考查，包括色谱柱的理论板数、分离

第33页：色谱条件的可变与不可变

▲各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如

第34页：理论板数考察

1.色谱柱的理论板数（n）考察柱效n值越大柱效越高tR 保留时间Wh/2半高峰宽★牛黄解毒片中黄芩的含量测定理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。★藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定理论板数按厚朴酚峰计算应不低于5000。

第35页：分离度考察

2.分离度（R）考察分离效果R值越大分离效果越好在规定的条件下，注入对照液或供试液，

第36页：重复性考察

3.重复性考察测量的精密度在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积

第37页：重复性计算例题

说明：原文另给出 X=19898.1、S=586.789、RSD=2.9%，判定为不符合规定。

第38页：拖尾因子考察

4.拖尾因子（T）考察色谱峰的对称性T值越接近于1.0色谱峰的对称性越好，测量的准确度越高。

第39页：上机测定

（三）上机测定按规定分别精密吸取一定量的对照液和供试液，注入色谱仪测定，记录色谱

第40页：数据处理与结果判断

• （四）数据处理和结果判断
• （1）利用保留时间（tR）进行定性鉴别
• （2）利用峰高（面积）进行含量测定
• （3）利用特征峰的

第41页：

第42页：定性鉴别保留时间比较法

• 四、HPLC在药品检验中应用
• 定性鉴别：（保留时间比较法）1.原理在同一色谱条件下，相同的成分具有相同的色谱

第43页：百令胶囊的鉴别

2.实例百令胶囊的鉴别本品为发酵虫草菌粉（CS-C-Q80）制成的胶囊。中国药典收载了

第44页：百令胶囊色谱条件

（1）色谱条件：C18柱，检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于3000，以乙睛为流动相A，以0.04mol/L磷酸二氢钾为流

第45页：腺苷与尿苷对照液制备

• （2）腺苷对照液制备取腺苷对照品适量，加0.5％磷酸溶液制成每1ml含12μg的溶液，即得。
• （3）尿苷对照液制备

第46页：百令胶囊供试液制备

（5）供试液的制备内容物（0.5g）置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，密塞，浸泡30分钟，滤过，弃去乙醚，挥干。连同滤纸一并置具塞锥形瓶中，加入0.5％磷酸溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.5％磷酸溶液补足减失的重量，摇匀。

静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。残渣供试液

第47页：百令胶囊测定法

（6）测定法分别吸取上述四种测试溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。除溶剂峰外，供试品色谱应呈现与

第48页：百令胶囊色谱图

腺苷尿苷25214356对照药材样品

第49页：外标法含量测定原理

（二）含量测定（外标法）1.原理在一定浓度范围内，被测成分的质量与其峰面积或峰高成线性关系。因此，可根据被测成

第50页：外标法计算步骤

• 2.计算步骤
• 计算：供试液中被测成分的浓度
• 计算：药品中被测成分的含量=A供A对C供Ｃ对因为：C供（μg/ml）=C对×A供A对所以：含量（g/g %）C供（mg/ml ）×稀释倍数×样品溶液体积（ml）取样量（g）×100%=

第51页：藿香正气水厚朴酚测定

3.实例藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中制成的液体制剂，每支装

第52页：

第53页：藿香正气水色谱条件

（1）色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-水（50:20:40）为流动相；检测波长294nm

第54页：

第55页：厚朴酚对照液制备

（2）对照品溶液的制备厚朴酚对照品适量甲醇溶解对照品溶液（0.2mg/ml）和厚朴酚对照品适量甲醇溶解对照品

第56页：厚朴酚供试液制备

（3）供试品溶液的制备样品5ml供试液加盐酸2滴氯仿振摇提取（10ml×3）氯仿蒸干甲醇溶解精密稀释至10ml

第57页：厚朴酚测定法

（4）测定法精密吸取上述三种溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（AR厚、AR和

第58页：对照品与供试品色谱图

对照品与供试品色谱图：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「对照品色谱图供试品色谱图」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第59页：厚朴酚浓度计算

【含量计算】①分别求算供试液中厚朴酚、和厚朴酚的浓度（mg/ml）C对为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度；A供为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积；A对为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。

第60页：厚朴酚含量计算

②分别求算药品中厚朴酚、和厚朴酚的含量（mg/支）含量厚（mg/支）＝C供厚（mg/ml）×10ml ×10ml×标示装量（ml/支）5ml ×5ml （取样量）含量和（mg/支）＝C供和（mg/ml）×10ml ×10ml×标示装量（ml/支）5ml ×5ml （取样量）

第61页：厚朴酚与和厚朴酚总量

③求算厚朴酚与和厚朴酚的总量含量厚（mg/支）+总量（mg/支）＝含量和（mg/支）

第62页：中药指纹图谱鉴定

（三）中药指纹图谱鉴定1.中药指纹图谱鉴定（fingerprinting）是以中药及其制剂有效部位的大部分成分，或全部特

第63页：银杏叶提取物的检查

3.实例银杏叶提取物的检查现行中国药典在银杏叶提取物品种检查项下，采用了HPLC

第64页：槲皮素对照液制备

②槲皮素对照液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含30μg的溶液，即得。

第65页：银杏叶供试液制备

④供试液的制备加甲醇-25％盐酸溶液（4︰1）混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温。【水解】水解液移至50ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液，即得。

供试液取样品约35mg

第66页：银杏叶测定法

⑤测定法分别精密吸取对照液和供试液各10μl，注入液相色谱仪测定，以对照品色谱峰

第67页：银杏叶色谱图

银杏叶色谱图：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「BC槲皮素山奈素样品」，建议对照原课件图片补充图示说明。

第68页：总银杏酸限量检查

• （2）总银杏酸限量检查
• ①色谱条件C18

第69页：总银杏酸供试液制备

④供试液的制备本品粉末约10g，精密称定供试液置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）50ml，称定重量回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚（60～90℃）补足减失的重量，摇匀，滤过。

精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得

第70页：总银杏酸测定法

⑤测定法精密吸取上述对照液和供试液各10μl，注入液相色谱仪测定，以总银杏酸色谱峰定位供试

第71页：

第72页：总银杏酸含量计算

【计算方法】▲求算供试品中总银杏酸的总峰面积AT＝∑Ai▲求算供试液中总银杏酸浓度CT（μg/ml）CT＝AT/AR×CRAR为银杏酸C13︰0对照品的峰面积CR为银杏酸C13︰0对照液的浓度（μg/ml）▲求算药品中总银杏酸的含量（ppm）含量（ppm）＝⑥药典规定：本品含总银杏酸不得过百万分之五CT（μg/ml）×2ml ×50ml25ml ×取样量（μg）×106i=1n

第73页：课程小结

• 小结：1.检验步骤
• 色谱适应性试验的意义：、项目和规定2.在药检中的应用
• 定性鉴别：（保留时间比较法）
• （2）含量测定（外标法）

第74页：结束页

结束页：本页以图片为主，源文件提取到的文字为「再见」，建议对照原课件图片补充图示说明。