04 第四章 体内药物分析方法的建立与验证.pptx

第1页：第四章体内药物分析方法的建立与验证

第四章体内药物分析方法的建立与验证

第2页：第一节 分析方法的设计依据

第一节分析方法的设计依据

第3页：一、分析方法的设计依据

• 一、分析方法的设计依据1.系统检索国内外的科技文献：2.了解待测药物的理化性质；3.药物在生物体内的存在状况；4.药代动力学参数；5.分析检测方法

第4页：二、建立分析检测

• 二、建立分析检测方法的主要依据1.待测药物的理化性质及体内存在状况2.分析测定的目的与要求3.生物样品的类型与样品制备方法4.实验室条件

第5页：药物的理化性质

• 1.药物的理化性质及体内存在状况选择预处理方法药物理化性质药物在体内存在状态代谢途径及代谢物性质

第6页：待测药物的理化性质亲脂性

待测药物的理化性质亲脂性；药物的pKa值；水和有机溶剂中的溶解度及分配系数。萃取方法和萃取条件的选择亲脂性：在适当的pH值下用有机溶剂萃取强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取挥发性：极性小有机溶剂萃取。

第7页：药物稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定－避免

药物稳定性萃取浓缩技术对酸碱不稳定－避免使用强酸或强碱溶剂对热不稳定－避免高温蒸发溶剂对光不稳定－避光操作

第8页：待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强

待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低影响分离萃取方法：蛋白结合较强不宜直接用溶剂萃取。体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定分析检测技术：浓度较低（尤其有代谢成分共存）考虑代谢产物的干扰应选择高灵敏度、高选择性测定方法（LC-MS , EIA）

第9页：分析测定的目的与要求根据体内药物分析的目

分析测定的目的与要求根据体内药物分析的目的决定分析方法的应用1.药代动力学研究要求:同时测定原形药物和代谢产物检测:宽线性范围（Cmax~Cmax的1/20）、高灵敏度（10-9g/ml）和高专属性方法:不必强调方法的简便、快速；重点考虑测定浓度范围较宽；多采用HPLC、GC-MS、LC-MS

第10页：临床治疗药物监测

• 2.临床治疗药物监测：测定有效治疗浓度范围内药物浓度；分析方法尽量简便易行、快速，适用于长期、批量样品；大多采用UV、RIA或EIA等。3．中毒患者的临床抢救药物浓度极高，不必强调方法的灵敏度，特别强调方法特异性，速度快；大多采用GC、GC-MS、RIA或EIA。

第11页：生物样品类型与预处理方法以血浆或血清为分

生物样品类型与预处理方法以血浆或血清为分析样品:HPLC检测－采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术。RIA分析－样品的预处理方法可较为粗放，经简单蛋白沉淀或不经预处理直接测定。

第12页：实验室条件实验室现有的或有可能在其它实验

实验室条件实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。

第13页：第二节 分析方法建立的一般步骤

第二节分析方法建立的一般步骤分析方法的选择分析方法的建立检测条件的筛选分离条件的筛选

第14页：一、分析方法的选择生物样品

• 一、分析方法的选择生物样品中药物浓度是决定分析方法的首要因素：药物或其特定代谢产物浓度低、样品量少，难以通过增加取样量提高方法灵敏度，只能通过选择适当的分析方法适应样品分析需求。

第15页：二、分析方法的建立初步拟定分析

• 二、分析方法的建立初步拟定分析方法通过大量试验工作，选择最佳分析条件，建立分析方法。分析方法的验证分析方法的建立与分析方法的验证紧密相关。

第16页：分析方法的建立步骤

分析方法的建立步骤：第一步：检测条件的筛选以待测药物对照品照拟定的分析方法（预处理除外）测定。根据测定结果确定最佳分析检测条件。例：HPLC－检测器、色谱柱、流动相、柱温、内标；使具有足够的方法灵敏度、良好的色谱参数（n，R，T）、适当保留时间。

第17页：第二步

第二步：分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰；确认以对照品确定的检测条件是否适用于实际生物样品。

第18页：空白溶剂试验

筛选分离条件步骤：1.空白溶剂试验（方法特异性）待测药物的非生物基质溶液（水溶液）采用拟定方法进行预处理，并测定响应信号。考察目标：预处理（衍生化反应、萃取分离）不干扰药物的测定。

第19页：空白生物基质试验

• 2.空白生物基质试验（方法的特异性）取空白生物基质，如空白血浆，用拟定的方法，照“空白溶剂试验”项下方法操作。考察目标：生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）。要求在待测药物（或活性代谢物、内标物质）的信号附近的有限范围内不应出现内源性物质信号。

第20页：模拟生物样品

• 3.模拟生物样品试验（方法的效能指标）取空白生物基质加入待测药物制成模拟生物样品，照“空白生物基质试验”项下方法试验。考察目标：方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、药物的萃取回收率、特异性（内源性物质的干扰）等各项技术指标。

第21页：色谱分析法

色谱分析法：还要考察待测药物（或内标物）与内源性物质（或其它药物）的分离情况。－色谱峰的保留时间、理论塔板数和拖尾因子是否与水溶液一致－色谱峰是否为单一成分－标准曲线的截距是否显著偏离零点

第22页：实际生物样品

• 4.实际生物样品测试－进一步验证内源性物质、代谢产物的干扰经空白生物基质和模拟生物样品试验后，确定的分析方法及其条件，不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定，因为药物在体内可能与内源性物质结合（如血浆蛋白结合物）或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物（或缀合物）。考察目标：代谢产物对药物、内标物质的干扰情况，进一步验证方法的可行性。

第23页：分离条件选择色谱图

分离条件选择色谱图：

第24页：第三节 分析方法验证的内容与要求

第三节分析方法验证的内容与要求验证分析方法的可行性与可靠性方法验证时应考虑影响分析方法所有可变因素（采样，样品制备，色谱分离，检测与数据评价），通常采用模拟生物样品和实际生物样品。

第25页：分析方法验证的内容

分析方法验证的内容：特异性线性范围精密度与准确度定量限与检测限稳定性分析方法的验证

第26页：一、方法特异性

• 一、方法特异性（专属性或选择性）方法的特异性（specificity）：系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质（药物、代谢物）的能力，表示所检测的信号属于待测物所特有。

第27页：内源性物质的干扰

• 1.内源性物质的干扰比较待测药物对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测信号。HPLC色谱峰的tR、n一致及与内源性物质色谱峰的R合乎要求。确证内源性物质对分析方法有无干扰。

第28页：

第29页：代谢产物的干扰

• 2.代谢产物的干扰比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号（tR、n、和R）是否一致；确证代谢产物对分析方法有无干扰。

第30页：伍用药物的干扰

• 3.伍用药物的干扰TDM时，考虑患者可能同时服用药物的干扰，比较待测药物、同时服用药物、模拟生物样品和添加同时服用药物的模拟干扰样品的检测信号。确证同时服用药物对分析方法的干扰情况。4.与参比方法的相关性参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。例：茶碱血浆样品用UV法和HPLC法测定结果的相关性

第31页：茶碱UV法与HPLC法测定结果比较

• 24681012142468101214.......Y=－0.107＋0.983X(r=0.9591，n=9)..茶碱血浆样品用UV法测定的结果茶碱血浆样品用H P L C法测定的结果

说明：源文件本页仅给出回归方程 Y＝－0.107＋0.983X（r＝0.9591，n＝9），原始成对数据缺失，无法还原为表格，建议对照原图补充。

第32页：三、标准曲线与线性范围

• 三、标准曲线与线性范围标准曲线：生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性，通常用回归分析法（最小二乘法或加权最小二乘法）获得标准曲线。标准曲线通常为线性模式。推荐文献：钟大放，以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题；药物分析杂志：1996，16（5）：343－346

第33页：线性范围

线性范围（linear rang）：标准曲线的最高与最低浓度的区间，在线性范围内药物浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

第34页：标准系列溶液的制备

标准系列溶液的制备：用模拟生物样品建立（空白血浆＋待测药物的对准品）注意：建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同生物基质制备。

第35页：标准系列溶液的制备（续）

标准曲线的一般建立方法：1.标准系列溶液的制备2.内标溶液的制备3.标准系列模拟生物样品的制备4.标准曲线的绘制

第36页：溶剂的选择

注意事项：1.溶剂－水或甲醇2.标准曲线至少含6个浓度点（不包括零点）可覆盖全部待测生物样品的药物浓度。3.标准曲线各浓度点等比梯度模式（比例常数约为2）如：1，2，5，10，20，50，100；实际制备时可先配高浓度依次稀释：100，50，20，10，5，2，1。4.浓度－加入的标准系列溶液的浓度应模拟生物样品中药物浓度的50倍以上，加入量为生物样品总体积2％以下，避免模拟生物样品与实际样品存在较大差异。

第37页：标准曲线的制备步骤

• 5.步骤：（1）先加入标准溶液（2）再加入空白生物基质（3）涡旋混匀

第38页：内标溶液的浓度

• 6.内标溶液的浓度：加入的内标溶液的浓度应为标准系列浓度的中间浓度7.标准曲线的绘制：以待测药物的检测信号（如色谱峰峰面积或峰高），内标法药物的检测响应应与内标物质检测响应的比值（因变量y）对模拟血药浓度（自变量x）求得回归方程y=ax+b，相关系数（r）。回归方程的截距应接近于零，r≥0.99（色谱法）

第39页：标准曲线的限度要求

• 8.标准曲线的限度要求：药代动力学或生物利用度研究：最高浓度应高于达峰浓度（Cmax）；最低浓度应低于Cmax的1/10~1/20，并应为方法的LOQ例：若体内平均达峰浓度为50ng/ml，其1/20为2.5ng/ml，设定最高浓度为100ng/ml，最低浓度为1ng/ml（个体差异）

第40页：三、准确度

• 三、准确度（accuracy）指用该方法测得的生物样品中待测药物浓度与其真实浓度的接近程度通常使用模拟生物样品测定（空白血浆＋浓度已知的对照品溶液），以测得的浓度与添加浓度比较计算。

第41页：准确度的测定法

测定法：取空白生物基质数份，在标准曲线范围制备高（接近上限）、中、低（接近LOQ）3个浓度，每一浓度至少5个样品，与随行的标准曲线同法测定，以测得的浓度与加入对照品溶液浓度比较计算。

第42页：准确度用相对回收率表示

一般用相对回收率（relative recovery，RR）或相对误差（relative error , RE）表示。测定值M，添加量A。

第43页：准确度的限度要求

限度要求：相对回收率85％～115％（LOQ附近80％～120％）RE±15％（LOQ附近±20％）

第44页：四、精密度

• 四、精密度（precision）系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度。表示该分析方法的可重复性，可反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一。使用模拟生物样品测定。

第45页：精密度的表示方法

标准偏差（standard deviation，SD）相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）批内（within-run or intea-assay）RSD批间（between-run or inter-assay）RSD日内（within-day）；日间（between-day）

第46页：精密度的测定法

测定法：取空白生物基质（血浆）数份，分别在同一批内或不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定。测定批内RSD（日内）：同一分析批内，用同一标准曲线同一实验条件下测定；每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每一浓度的RSD。

第47页：测定－批间RSD（日间）

测定－批间RSD（日间）：至少5个工作日内完成。每个工作日内完成3个浓度（高、中、低），每一浓度1个样品，用随行标准曲线计算日间RSD。限度要求：在药代动力学和生物利用度研究中RSD一般应≤15％在LOQ附近RSD应≤20％。

第48页：准确度和精密度可采用同一组数据

准确度和精密度可采用同一组数据，采用不同数据处理方法计算结果：

第49页：五、定量限

• 五、定量限（limit of quantitation,LOQ）是保证被测药物具有一定准确度、精密度的前提下，该分析方法能够准确测定生物样品中药物的最低浓度（通常为标准曲线上的最低浓度点）。样品制备：取空白血浆，制备至少5个独立的QC样品

第50页：LOQ的准确度要求

LOQ的准确度应在真实浓度的80％～120％范围内；精密度的RSD应小于20％； LOQ限度要求：至少能满足测定3－5个半衰期后生物样品中的药物浓度（或能检测出Cmax的1/10~1/20时的药物浓度）测定方法：其浓度应使S/N≥10，同时进行准确度和精密度验证。

第51页：受试药物的Cmax

受试药物的Cmax：3.202±0.496ug/mlLOQ为0.1ug/ml＜0.16ug/ml（Cmax的1/20）且RSD＜20％，RE％＜20％

第52页：六、稳定性

• 六、稳定性方法稳定性：1.待测药物及其分析溶液在实验室的温度、湿度、光照及暴露空气等条件下的稳定性2.模拟生物样品在预处理过程中的稳定性3.提纯后的残渣及其复溶溶液的稳定性

第53页：短期稳定性

生物样品稳定性：1.短期稳定性：室温、4℃或－20℃以及冻－融循环条件下的稳定性2.长期稳定性：实际生物样品经长期冷冻后的稳定性，包括待测药物或特定代谢物的降解。考察期限从采样至分析完毕整个时间区间。

第54页：稳定性试验的样品制备

样品制备：选择高、中、低3个浓度QC样品，在不同条件下，存放不同时间后，每个样品重复测定3次（n = 9）目的：是确定生物样品测定的时间及存放的条件和时间。

第55页：七、提取回收率

• 七、提取回收率（绝对回收率）取待测药物对准品加入空白基质中，制备高、中、低三个浓度模拟样品，按样品处理方法处理，计算提取回收率，应一致、精密和可重现。测定法：每个浓度测定5个样品；另取等量相同浓度的标准溶液，不经提取处理，直接溶解后测定。

第56页：提取回收率的计算方法

计算方法：AT：经萃取后的样品的检测信号或比值（内标法）AS：未经萃取的标准溶液的检测信号或比值（内标法）提取回收率限度要求：一般应≥50％；高、中浓度的RSD应≤15%；低浓度的RSD应≤20％。

第57页：八、质量控制

• 八、质量控制在实际生物样品的测定过程中对分析数据质量（精密度、准确度、提取回收率及样品稳定性）的监控

第58页：质控样品（QC样品）

质控样品（QC样品）将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制成的模拟生物样品，用于整个分析过程的质量控制。一般配制高、中、低三种浓度QC样品（6个）以低→高或高→低的顺序，按一定间隔均匀穿插于实际生物样品分析的全过程。和实际样品一样用随行标准曲线计算

第59页：QC样品浓度点选择

QC样品浓度点选择：低浓度选择接近定量下限，在LOQ的3倍以内高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度例：4000、2000、1000、500、250、100、50ng/ml

第60页：限度要求

限度要求：质控样品测定结果的偏差一般应小于15％，低浓度点偏差一般应小于20％，最多允许两个不在同一浓度的质控样品结果超限，如不合格，则改天样品测试结果作废。使用质控样品的试验可以考察准确度、精密度、稳定性和提取回收率是否符合规定。

第61页：第四节 体内药物分析方法应用示例

第四节体内药物分析方法应用示例第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究。

第62页：一、文献调研

• 一、文献调研理化性质：在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。

第63页：药动学参数

药动学参数吸收过程－空腹口服后吸收迅速，人体生物利用度约为49％～70％达峰浓度（Cmax）－口服500mg后平均为2.4~2.6mg/L；达峰时间（Tmax）－1～2h；蛋白结合率－20％～40％；代谢－口服给药24h内，40％～50％原形、15％以代谢物经肾排出。

第64页：体内分析方法

体内分析方法：RP-HPLC色谱柱－ODS色谱柱；流动相－甲醇（乙腈）-磷酸（枸橼酸）缓冲液（三乙胺调节pH2.3~3.5）；检测－紫外或荧光检测。

第65页：生物样品预处理方法

生物样品预处理方法 蛋白沉淀法－甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法－二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂提取 蛋白沉淀-溶剂萃取法－乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取。

第66页：二、分析方法设计

• 二、分析方法设计1．分离检测方法本试验为生物等效性研究－测定血浆中环丙沙星原形药物的血药浓度－时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法，紫外或荧光检测。

第67页：紫外检测灵敏度

紫外－灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100ul进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2ug/ml以上时基本可满足生物等效性研究要求。荧光－灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求

第68页：生物预处理方法

• 2.生物预处理方法初步拟定－采用乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样经试验，色谱峰理论板数、对称性下降（前沿峰），进而导致检测灵敏度降低。此预处理方法不合适。经进一步试验确定为：血浆0.5ml→乙腈1m沉淀蛋白→二氯甲烷－异丙醇（95︰5）5ml萃取→60℃氮气流吹干→流动相200ul溶解→20ul进样。

第69页：三、实验方法

• 三、实验方法1．给药方案20名受试者随机分成两组，每组10人第一次试验：第一组口服受试制剂（相当于环丙沙星500mg），第二组口服相同剂量的参比制剂第二次试验：第一次服药后第七天开始，两组交换给药。

第70页：血样的采集与处理

• 2.血样的采集与处理吸收分布相至少4点，平衡相足够点，消除相6点以上（至3～5个T1/2或持续采样至血药浓度Cmax的1/10~1/20后）总采血点12点以上。两周期之间的清洗期在10个T1/2以上。

第71页：给药后血样采集时间点

分别口服给药前（0h）和给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h（5～7个T1/2），由肘正中静脉取血4ml，立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟（3000rpm）分离血浆-20℃冰箱中保存待测。

第72页：血浆样品分析

• 3.血浆样品分析法色谱条件：高效液相色谱仪（包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器）；色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm×4.6mm，5um)流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液（86：14）；流速1.0ml/min，柱温为40℃；检测波长为λex=277nm，λem=445nm；内标物质－诺氟沙星

第73页：血浆样品的预处理

血浆样品的预处理：取血浆0.5ml，加内标溶液（10ug/ml诺氟沙星甲醇溶液）50ul、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇（95︰5）混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60℃下氮气流吹干，残渣加流动相200ul，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20ul进样。

第74页：四、分析方法验证

• 四、分析方法验证1.方法特异性环丙沙星峰tR＝12.4min，诺氟沙星（内标物质）tR＝10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰tR＝8.6min对测定无干扰。用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代谢物有干扰。

第75页：标准曲线与线性范围

• 2.标准曲线与线性范围标准系列溶液－取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20、50ug/ml的标准系列溶液，冰箱保存。标准系列模拟血浆样品－取空白血浆0.5ml，加环丙沙星标准系列溶液各50ul，配制成相当于浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0ug/ml的QC样品，冰冻（-20℃）

第76页：标准曲线的制备

取标准系列模拟血浆样品，照“血浆样品的预处理与分析”项下方法操作，以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵坐标，用加权最小二乘法求得的直线回归方程为：Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.1~5.0ug/ml)

第77页：方法精密度与准确度

• 3.方法精密度与准确度QC样品浓度为0.1、0.5和2.0ug/ml分析批次3个浓度，每个浓度6次测得浓度0.098、0.453和2.12ug/ml准确度RE(%)－-1.2%、-9.3%和6.4%精密度批内（％）－6.7%、4.6%和3.9%批间（％）－8.9%、9.6%和12.3%

第78页：方法定量下限受试制剂的Cmax

• 4．方法定量下限受试制剂的Cmax：3.202±0.496参比制剂的Cmax：3.300±0.730ug/ml ;LOQ为0.1ug/ml＜0.16ug/ml（Cmax的1/20）

第79页：样品稳定性

• 5.样品稳定性

第80页：提取回收率

• 6.提取回收率取空白血浆0.5ml，按“标准曲线”项下方法制备低、中、高三个浓度（分别为0.1、0.5、2.0ug/ml）的QC样品，并以相应浓度的未经处理的溶液比较，计算环丙沙星与内标物的提取回收率。

第81页：提取回收率测定结果

• 0.1ug/ml－67.7%(RSD为2.5%)0.5ug/ml－68.3%(RSD为4.2%)2.0ug/ml－67.4%(RSD为11.1%)内标物－64.5%(RSD为4.8%)，均大于50％，且结果稳定。

第82页：实验记录

实验记录 详细描述所用分析方法 提供每天标准曲线、质控样品和未知样品结果 全部未知样品色谱图 每个受试者血药浓度－时间曲线（包括受试制剂和参比制剂）

第83页：每个受试者血药浓度－时间曲线

每个受试者血药浓度－时间曲线（受试、参比）

第84页：平均血药浓度－时间曲线

平均血药浓度－时间曲线（受试、参比）

第85页：五、试验结果健康受试者口服盐酸环丙沙星

• 五、试验结果健康受试者口服盐酸环丙沙星500mg的受试制剂和参比制剂后，测得不同时间点血药物浓度。计算得以下药动学参数：AUC0-t、Cmax、Tmax

第86页：血药浓度－时间曲线下面积AUC

血药浓度－时间曲线下面积AUC0-t－梯形法AUC0-∞－公式计算达峰浓度（Cmax）－实测值达峰时间（Tmax）－实测值消除半衰期（T1/2）－实测值生物利用度（F）－计算法

第87页：方差分析

方差分析：将主要药动学参数经对数转换后进行方差分析，结果显示：受试制剂与参比制剂中盐酸环丙沙星的AUC0-t、Cmax、Tmax、T1/2均无显著性差异。双单侧检验：进一步采用双单侧检验和（1-2α）置信区间分析AUC0-t、Cmax、Tmax、T1/2均拒绝不等效假设，受试制剂AUC0-t的90％置信区间为参比制剂的95～110.5%，表明两种制剂具有生物等效性。

第88页：本章小结

本章小结1.分析方法的设计依据（4项）2.分析方法建立的一般步骤检测条件的筛选、分离条件的筛选3.分析方法验证的内容：特异性、标准曲线和范围、准确度、灵敏度、定量下限、稳定性、提取回收率4.分析方法验证的要求。