06 第六章 色谱分析法.pptx

第1页：第六章色谱分析法

第六章色谱分析法

第2页：色谱法的概念

色谱法（chromatography）主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数或吸附能力的差异而达到分离，并在检测中能检出其信号，从而达到分离、分析的一类分析方法。

第3页：色谱法的分离原理

色谱法是一种物理或物理化学分离分析方法。具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。在体内药物分析中常作为评价其他方法的参比方法.

第4页：第一节薄层色谱法

第一节薄层色谱法一、概述薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

第5页：二、定量分析

• 二、定量分析（一）目视比较定量法在同一薄层板上比较样品和纯品斑点大小及颜色深浅，估计样品的大概含量。

第6页：（二）洗脱法用适当的方法

（二）洗脱法用适当的方法将斑点位置的吸附剂全部取下，用溶剂将组分洗脱下来，再用光度法或其它分析方法定量。此法要求斑点无拖尾，组分洗脱率要高，比较麻烦费时。

第7页：（三）薄层扫描法

（三）薄层扫描法1.原理薄层扫描法（thin layerchromatography scanning method，TLCS）是指用薄层扫描色谱斑点含量的一种方法，该法目前已成为薄层色谱常用的定量方法，并在体内药物分析中得到应用。

第8页：薄层扫描法的原理

系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。

第9页：单波长与双波长扫描

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描测定和计算。

第10页：薄层扫描法的特点

• 2.特点实现操作的规范化和自动化3.定量方法薄层扫描的定量方法有外标法和内标法。应用较多的是外标法，即根据标准品峰面积与浓度（含量）的标准曲线和样品的峰面积计算其含量的方法。它又分为外标一点法和外标两点法。

第11页：（1）外标一点法

• （1）外标一点法（用于标准曲线通过原点的情况）指在同一薄层板上，用一个浓度的对照品与样品进行对照定量的方法。一般要求对照品和样品的斑点各2～4个，分别测出其峰面积后取平均值，再计算样品的含量。

第12页：（2）外标二点法

• （2）外标二点法（用于标准曲线不通过原点的情况）用两种不同浓度或同一浓度两个不同点样量的对照与样品进行对照定量的方法。

第13页：

第14页：第二节气相色谱法

第二节气相色谱法一、概述以气体作为流动相的色谱法叫气相色谱法（gas chromatography，GC）。它适用于分离、分析有一定挥发性和热稳定性的化合物。

第15页：二、气相色谱仪

• 二、气相色谱仪1.载气系统GC的气路是个连续运行的密闭系统，包括气源、气体净化和气体流速测量和控制等装置。气路的气密性、载气流量的稳定性和流量测量的准确性对GC的测定非常重要。（一）气相色谱仪

第16页：进样系统

• 2.进样系统包括进样器、气化室和温控装置。液体样品进入色谱柱前必须在汽化室内瞬间变成蒸气。

第17页：检测系统

• 4.检测系统包括检测器和温控装置。5.数据采集和处理系统包括放大器、色谱工作站。3.分离系统包括色谱柱、柱箱和温控装置。

第18页：气相色谱仪结构示意图

气相色谱仪结构示意图：图中各编号部件如下。

• 1 高压气瓶
• 2 减压阀
• 3 净化器
• 4 气流调节阀
• 5 流量计
• 6 压力表
• 7 进样器
• 8 色谱柱
• 9 检测器
• 10 记录仪
• 11 恒温箱
• 12 放空口
• 13 检测器电源
• 14 数据处理系统

第19页：色谱柱

色谱柱起分离作用，检测器起检测作用。色谱柱和检测器是气相色谱仪的两个核心部件。

第20页：（二）载气

（二）载气GC常用的载气为N2、H2、Ar和He等。载气的选择主要由检测器的性质及分离要求而定。载气进入色谱仪前必须经过净化处理。

第21页：（三）进样

（三）进样1.溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样，进样量一般不超过数微升。2.顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。

第22页：分流进样

• 1.分流进样2.顶空进样

第23页：（四）色谱柱

（四）色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。（五）检测器检测器是气相色谱仪的另一重要的组成部分，其作用是把从色谱柱流出的各组分的含量变化转变成可测量的电信号（电流或电压）变化，由记录仪记录下来，进行定量和定性分析。

第24页：氢焰离子化检测器（FID）

• 1.氢焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）氢焰离子化检测器是一种高灵敏度的检测器。它几乎对所有的有机物都有响应。

第25页：FID检测器的原理

FID检测器是利用有机物在氢火焰中燃烧成离子，在高压电场作用下形成离子流电信号。需要注意，有机物的电离程度与被测组分的性质有关，所以相同量的不同物质，产生的电信号大小可能不同。

第26页：FID检测器的响应机理

组分进入氢火焰，燃烧过程中直接或间接产生离子，在有电位差的收集极（阳极）与极化环（阴极）间作定向流动而形成电流（约10-7A）。经放大，而后由记录器记录流出曲线。检测限为50ng以下。

第27页：FID测定注意事项

测定时要调节好检测器的温度，防止水蒸汽的冷凝。另外，要注意安全，氢气钢瓶一定要用专用钢瓶，氢气管路不能漏气。

第28页：氮－磷检测器（NPD）

• 2.氮-磷检测器（nitrogen phosphorus detector，NPD）氮磷检测器（NPD）也称热离子检测器（TID），是一种只对含氮或磷的有机化合物具有高选择性和高灵敏度的检测器。

第29页：NPD的适用范围

对于含N或含P化合物的测定，NPD比FID分别灵敏大约50倍和500倍。因此适用于含氮或磷的药物及代谢产物等痕量分析。

第30页：电子捕获检测器（ECD）

• 3.电子捕获检测器（electroncapturedetector，ECD）电子捕获检测器是一种对电负性物质有高选择性和高灵敏度的检测器。它是利用放射源产生的放射线使载气分析离子化，形成稳定基流。当有含电负性基团的组分通过检测器时，俘获电子，使基流下降而产生信号。

第31页：ECD的工作原理

阳极与阴极之间加有直流或脉冲电压，当纯载气通过时，遇到放射源的电子流，产生低能量的次级电子及正离子，电场中向极性相反的电极运动，产生基流。当电负性组分进入时，捕获低能电子，产生讯号，放大，即色谱峰。该方法对除F以外的卤素、S、P、O、N响应。

第32页：ECD使用注意事项

ECD使用时要注意一定不能超过其最高使用温度（3H为250℃以下，63Ni为350℃以下），以防止放射源流失。否则，不仅损坏检测器，且造成放射污染。

第33页：ECD载气纯度要求

使用的N2一定要高纯度99.99%以上，载气中微量的O2和H2O对检测器影响较大，需净化处理。且进样量不宜过大，尤其是高沸点物质，以防止污染检测器。平时不用时要将检测器出口堵住，或一直低速度通高纯氮，防止空气扩散进去。

第34页：ECD的选择性

电子捕获检测器只对含有卤素、硫、磷、氮、氧等电负性强的元素的物质有响应，化合物所含元素的电负性越强，灵敏度越高。

第35页：质谱检测器GC-MS

• 4.质谱检测器GC-MS

第36页：色谱系统适用性试验

指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。包括理论板数（n）、分离度（R）、重复性和拖尾因子（T）等四个指标。（一）色谱系统适用性试验三、定量分析方法

第37页：理论板数

• 1.理论板数色谱柱的理论板数越多，柱效越高。

第38页：分离度

• 2.分离度药典要求R应
• 1.5

第39页：重复性

用对照溶液，连续进样5次，峰面积RSD应≤2.0%；或配制相当于80%、100%、120%的对照液，加入规定的内标，分别进样3次，计算平均校正因子，RSD亦应≤2.0%。3.重复性

第40页：拖尾因子

• 4.拖尾因子峰高法定量时T应在0.95～1.05之间

第41页：（二）内标法

（二）内标法1.基本原理内标物+对照品→对照溶液，进样，测定，计算校正因子

第42页：内标法测定步骤

供试品+内标→供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量

第43页：内标物的选择原则

• 2.内标物的选择原则供选作内标的化合物，其理化性质应与被测药物相近。在实际工作中，一般选择化学结构与被测药物相似的化合物作为内标物，其选择原则如下：

第44页：内标物的选择条件

• （1）内标物与被测药物只差一个化学元素（2）内标物与被测药物为同系物（3）内标物与被测药物结构相似

第45页：内标物的应用示例

• 3.内标物的应用

内标物应在样品预处理之前等量加入，在相同条件下进行预处理后进样分析。 以峰面积比值对药物标准品浓度作图或进行回归的标准曲线或回归方程，用于体液样品中药物含量测定。 加入内标物既可消除误差，又可使操作简化。

第46页：多内标物的应用

• 4.多内标物的应用血浆中地西泮(安定)及其代谢物去甲安定的测定100:1

第47页：（三）外标法

（三）外标法1.工作曲线法目前采用建立回归方程的方法来代替工作曲线法。供试品→供试品溶液对照品→对照品溶液2.外标一点法进样，测定

第48页：四、应用示例

• 四、应用示例（一）GC-FID测定血清中丙戊酸钠浓度1．色谱条件2m×3mmID不锈钢柱，充填以涂渍15％FFAP的Gas Chrom Q（80～100目），FID检测器。柱温200℃，汽化室和检测器温度分别为220℃和235℃，N2，H2和空气的流速分别为45ml/min、45ml/min和450ml/min。内标：环己烷羧酸钠

第49页：方法与结果

• 2．方法与结果（1）标准曲线制备：（2）样品测定：血清样品色谱图1．丙戊酸2．内标物（3）方法精密度：

第50页：（4）方法回收率

• （4）方法回收率：取已知含SVP浓度为14.6 mg/L的混合血清样品再加人一定量的SW，使其浓度为77.1mg/L，照样品测定法测定含量5次，测得平均值为76.72±1.0l，扣除原有量后，计算平均方法回收率为99.5±1.6％。

第51页：讨论

• 3．讨论（1）萃取条件选择：SVP不溶于极性小的有机溶剂，需经酸化转变为丙戊酸后才能用有机溶剂萃取，本实验考察了使用不同浓度的硫酸酸化，用不同量的正己烷和三氯甲烷萃取。实验结果表明，用低浓度硫酸(1mol／L)酸化时，萃取回收率低，用3和6mol／L硫酸酸化时萃取回收率相近，但用三氯甲烷提取时杂质峰3moL／L的比6mol／L的大。相同条件下正己烷比三氯甲烷萃取的回收率低，且正己烷的溶剂峰比三氯甲烷大。因此本实验选用6mol／L硫酸酸化，用三氯甲烷提取。

第52页：（2）色谱条件

• （2）色谱条件：使用涂渍15％FFAP的Das Chrom Q(80～100目)不锈钢色谱柱，通过提高柱温使丙戊酸和环己烷羧酸的保留时间分别由大于12min和20min，缩短为5.50min和9.47min，色谱峰形好，而且杂质峰不干扰测。（3）内标的使用：采用环己烷羧酸钠作内标，用SVP一起酸化后萃取，消除萃取操作中误差。

第53页：GC-FID测定血清中布洛芬浓度

GC-FID法测定血清中布洛芬浓度样品处理方法取血清样品0.5ml，置5ml具塞离心试管中，加水0.5ml混合，加正己烷2ml，氯化钠0.5g，振摇3min，离心10min(3000r/min)，吸出上清液，置10ml具塞离心试管中，余留液中加2ml正己烷，振摇提取3min，离心，吸取上清液，合并上清液，置40℃水浴中，通氮气吹干。加三氟硼甲醇液1ml，置60℃水浴中5min，加正己烷0.5ml，振摇0.5min，静止分层。取上层液1μl进样气相色谱仪分析。

第54页：GC-ECD法测定示例

（二）GC-ECD测定血浆中盐酸可乐定1.样品前处理与测定方法于血浆样品中加入20μl内标溶液(0.1mg/ml)及pH13的氯化钾一氢氧化钠缓冲液1 ml，用乙酸乙酯6ml提取，充分振荡后离心(3500r/min, 5min)，将有机层转移至10ml离心管，加0.1mol/L的盐酸溶液l ml，再振荡提取，离心后弃去有机层，水层中再加pHl3的氯化钾-氢氧化钠缓冲液1.5rnl后，用乙酸乙酯5ml提取，分取乙酸乙酯层并于常温下用氮气吹干。于残渣中加入衍生化试剂bisTMFBO2μl，混匀后置65℃温度下放置4h，再于80℃用氮气流吹干，残渣用正己烷200μl溶解后，再用pH8的磷酸盐缓冲溶液1 ml洗涤，取洗涤后的正己烷层1μl进样。

第55页：讨论

• 2.讨论（1）衍生化试剂的选择从可乐定结构可知，衍生化易产生单、双取代。本文对4种衍生化试剂：五氟苄溴（Ⅰ）、七氟丁酸酐（Ⅱ）、五氟苯甲酰氯（Ⅲ）和bisTFMBO（Ⅳ）进行了比较。由于(Ⅰ)灵敏度低，（Ⅱ）血浆空白有干扰，（Ⅲ）单、双取代衍生物比值不稳定，（Ⅳ）则具有灵敏度高、血浆空白不干扰、衍生物稳定等优点，故选择bisTFMBO。

第56页：可乐定的衍生化条件

• （2）衍生化可乐定条件的选择采用大量衍生化试剂或衍生化时间达12h以上，可得到单一的双取代峰。衍生化试剂量大不易除去，对ECD检测器污染严重，分析时间长。当选择2μl衍生化试剂于65℃反应4h，用的标准液（400ng／ml）进行试验，测得可乐定单取代物的峰高与其双取代物的峰高之比基本不变，重现性好，其衍生化物稳定（3d）。选择双取代峰进行定量测定，结果良好。

第57页：内标的选择

• （3）内标的选择曾据文献选用苯并咪唑，但与抗凝剂肝素峰分离不好。盐酸普萘洛尔提取条件与可乐定一致，提取率可达95%以上，其衍生物稳定性好，与样品峰分离好，血浆中内源性物质对测定无干扰，是比较理想的内标物。

第58页：（三）毛细管气相色谱

（三）毛细管气相色谱法测定血浆中平痛新1．色谱条件NPD检测器；交联SE-54石英毛细管柱(30m×0.25mm ID)；载气N2，柱前压力为1.0kg/cm2；H2为100kPa；进样室温度为280℃，检测室温度为300℃；柱温初始温度为180℃，先以20℃/min升温至240℃后，再以5℃/min升温至250℃，保持7min；1min内不分流，1min后分流；

第59页：毛细管GC测定的样品前处理

• 2．样品前处理取离心后狗血浆1.0ml，加内标（奥芬那君）lμl及0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml，混匀，加环己烷5ml，混匀离心，取有机相加0.1mol/L盐酸溶液3ml，混匀离心，弃去有机层，水层加0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml、环己烷5ml，混匀离心，取有机相于60℃水浴中氮气流下吹干，残渣加甲醇100μl充分溶解，取1.0μl进样。样品和内标的保留时间分别为10.3和8.5min。

第60页：

第61页：标准曲线与回归方程

• 3．标准曲线与回归方程配制20，50，100，200，300，600ng/ml的盐酸平痛新标准溶液和200ng/ml内标溶液，取上述标准溶液和内标溶液各100m加至盛有1.0ml空白血浆的10ml离心管中，加0.5mol/L氢氧化钠溶液1ml，混匀5s，下同样品处理项下“加环己烷5ml……”.以样品对内标的峰面积比X对样品浓度Y(ng/ml血浆)回归得回归方程为：Y=-4.88+377.06X r=0.9992当信噪比为5：1时的样品检测限为5ng/ml血浆。

第62页：回收率与精密度试验

• 4．回收率与精密度试验

第63页：血药浓度测定

• 5．血药浓度测定

第64页：第三节高效液相色谱法

第三节高效液相色谱法一、概述高效液相色谱法（high performanceliquid chromatography, HPLC）是以高压输出的液体为流动相的色谱技术。

第65页：

第66页：高效液相色谱仪的组成

由五大部分组成：另外，还配有辅助装置，如梯度洗脱装置，自动进样装置等高压输液系统进样系统分离系统检测系统记录和数据处理系统

第67页：（一）高压输液系统

（一）高压输液系统高压输液系统一般由贮液器、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻尼器等组成，其中高压输液泵是高效液相色谱仪的核心部件。

第68页：柱塞往复泵的特点

柱塞往复泵具有体积小、循环快、流量恒定，泵中保留的溶剂很少，容易清洗及更换流动相等特点。泵流速精密度的标准偏差小于1％；泵的泵压一般可达到400kg/cm2。

第69页：梯度洗脱

梯度洗脱（gradientelution）也称溶剂程序。对于一些组分复杂或容量因子k范围很宽的样品的分离尤为重要。

第70页：梯度洗脱的原理

梯度洗脱是在分离过程中，按一定程序不断改变流动相的配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，从而改进复杂样品的分离，改善峰形、缩短分析时间，以提高分离效率。梯度洗脱装置分低压梯度洗脱装置和高压梯度洗脱装置。

第71页：高压梯度洗脱装置

高压梯度洗脱装置一般采用二台或多台高压泵，按设定的流量比例将各种溶剂送入混合室，在高压下进行混合，然后进入色谱柱。其优点是能得到任意形式的梯度曲线，梯度重复性和精度高，自动化程度高。但需要多台泵，仪器造价也高。

第72页：

第73页：（二）进样系统

（二）进样系统高效液相色谱法对进样要求较严。目前普遍采用的手动进样方式是六通阀进样。1235442351装样进样图六通阀进样示意图1.定量管2.色谱柱3.可转动阀芯4.试样入口5.流动相进口

第74页：自动进样器

自动进样器

第75页：

第76页：（三）色谱柱

（三）色谱柱1．柱管与柱填料色谱柱由柱管与固定相组成，采用匀浆高压装柱。色谱柱分为分析型柱和制备型柱两类。分析型的柱长为10～30cm，内径为2～6mm；制备型的柱长为25～100cm，内径为20～40mm.

第77页：色谱柱填料的类型

填料类型不同液－固吸附色谱固定相为吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、分子筛；液－液分配色谱固定相一种为物理涂渍固定相，另一种为化学键合固定相。在药物分析中，多采用硅氧烷型化学键合固定相。化学键合固定相按极性强弱可分为极性、中等极性和非极性三类。极性键合固定相有氨基、氰基键合相等。氰基键合相适用于分析极性和中等极性药物；中等级性键合相常用的有醚基键合相；非极性的键合相常用的有十八烷基键合相，适用于分析非极性或弱极性的药物。

第78页：预柱与保护柱

• 2．预柱与保护柱在体内药物分析中，为延长色谱柱的使用寿命，不降低柱效，常在进样器前装一根预柱，其作用是平衡流动相和吸附流动相中的杂质，使其不污染分析柱。为了防止分析柱被较脏的样品和流动相中的杂质污染，常在进样器与分析柱之间，装一根填料与分析柱完全相同的短柱作为保护柱。

第79页：（四）检测器

检测器连在色谱柱的出口端，被色谱柱分离后的样品各组分随流动相流入检测器，样品种的各组分在流动相中的浓度或物理量的变化，由检测器连续地转换成电信号，在记录器上迅速的给出直观信息。（四）检测系统

第80页：HPLC常用检测器

UVVWDDADFDELSDMS不同的检测器对同一样品的灵敏度不同，选择性不同，给出的定性或定量信息不同紫外检测器

第81页：紫外检测器

• 1．紫外检测器紫外检测器（ultravioletdetector，UV）适用于被测样品组分的分子结构中含有π→π共轭及n→π共轭药物的检测。单波长紫外检测器可调波长紫外检测器VWD二极管阵列紫外检测器DAD

第82页：紫外检测器的工作原理

紫外检测器的工作原理和结构与一般的紫外分光光度计一样，所不同是将样品池改为体积很小（5～12µl）的流通池（如图所示），以对色谱流出样品进行连续检测。11223光路Z型H型

第83页：可调波长型紫外可见检测器

可调波长型紫外可见检测器是以钨灯和氘灯作为光源，检测波长从190～800nm连续可调，样品可以选择在最大吸收波长处进行检测，灵敏度高。因此，该类检测器应用广泛。需要注意的是所使用的流动相溶剂在测定波长下应无吸收。

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第85页：二极管阵列检测器（DAD）

二极管阵列检测器特点是对整个紫外－可见光谱区波长同时进行检测，获得三维的色谱－光谱图形，对每一个色谱峰都给出光谱定性信息。

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第87页：

第88页：三维色谱光谱图

YXZ吸光度波长时间光谱平面色谱平面三维色谱－光谱图

第89页：紫外三维色谱光谱图

紫外三维色谱光谱图

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第91页：紫外检测器的特点

紫外检测器的特点是：1)灵敏度高，最小检测浓度为10-9g/ml，可准确方便地进行定量分析；2)线性范围宽；3)对温度和流动相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱；4)应用范围广泛。

第92页：荧光检测器

• 2.荧光检测器（Fluorophotometric detector，FD）比紫外检测器有更高的灵敏度和选择性，其灵敏度可检测到10-10g/ml的药物。只适用于能产生荧光或能生成荧光衍生物的药物。

第93页：荧光检测器的特点

特点：1)灵敏度比紫外光检测器高几个数量级。例如，麦角二乙胺体液样品，可达1pg；2)专一性较高，不易受代谢物的干扰；3)条件要求较严，耐用性较差。

第94页：电化学检测器

• 3．电化学检测器(electrochemical detector，ECD)原理:在两电极间施加一恒电压，在组分发生氧化或还原时，连续测量通过的电流，并记录对时间的函数系。氧化电压或还原电压及其检测的可能性，取决于被测样品组分的氧化或还原电位。所用的流动相必须具有一定电导率，一般为盐类或有机溶剂与水的混合液。

第95页：电化学检测器的特点

特点：1)宽的线性测定范围2)高的灵敏度，检测限可达10-12g/ml。3)具有更好的专属性，可用于色谱行为相似而电化学性质不同的化合物的测定4)应用范围有限

第96页：蒸发光散射检测器（ELSD）

• 4.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（evaporative lightscattering detector，ELSD）是一种通用型检测器，对任何组分响应无歧视。

第97页：ELSD检测三步曲

ELSD检测三步曲示意图雾化蒸发检测

第98页：

第99页：ELSD的应用

应用：糖、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三脂及甾体类等化合物。注意：流动相必须是能挥发的，如甲醇-水，乙腈-水等，而不能用含盐的流动相，因盐不挥发，影响检测。若需调节流动相pH值，可用氨水、醋酸等。

第100页：ELSD适用的药物

氨基糖苷类、银杏内酯及肌肉松弛药ELSD检测的HPLC色谱图

第101页：三、常用色谱分离方法

• 三、常用色谱分离方法及其应用（一）液－固吸附色谱法流动相为液体，而固定相为固体吸附剂的色谱法，称为液－固色谱法，是根据被测样品组分吸附作用的不同来进行分离。常用的固定相均为具有吸附活性的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺和高分子多孔微球等，其中硅胶是应用最广泛的一种。

第102页：液－固吸附色谱的分离原理

分离原理：是靠被分离样品组分与流动相分子争夺固定相填料表面的活性中心来实现。如果流动相是极性的，它将与固定相填料表面稳定结合，弱极性的样品组分会很快从柱中流出，则样品组分的保留时间短；若流动相比样品组分的极性弱，则样品组分将与固定相填料表面稳定结合，从柱中流出的就慢，样品组分的保留时间就长。

第103页：（二）液－液分配色谱

（二）液－液分配色谱法其分离原理是根据样品组分在流动相和固定相中的相对溶解度或分配系数的差异。固定相应是样品组分较好的溶剂，而流动相应是样品组分较差的溶剂。

第104页：正相与反相分配色谱

流动相极性大于固定相极性。固定相为十八烷基硅烷健合硅胶（ODS或C18柱）或辛烷基硅烷健合硅胶（C8柱），流动相是甲醇－水或乙腈－水，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物。反相高效液相色谱法

第105页：

第106页：（三）离子交换色谱

（三）离子交换色谱法离子交换色谱柱中的填料含有极性基团，而且可离子化，如羧酸、磺酸或季铵离子等。在合适的pH值下，这些基团将离解，吸引相反电荷的物质。离子交换色谱法，就是利用离子性物质能与色谱柱中的填料反应，而达到分离的目的。用于极性组分的分离。

第107页：（四）分子排阻色谱

（四）分子排阻色谱法基于被分离样品组分的分子量大小不同而对样品组分进行分离的一种色谱方法，是一种获得有关合成聚合物分子量和分子量分布情况的标准分离检测方法。此法也广泛应用于分离天然存在的大分子，如组织提取物、核酸、蛋白质等。

第108页：分子排阻色谱的固定相

分子排阻色谱法常用的固定相是有一定孔径的多孔性填料，小分子量的样品组分可完全进入孔中，而流动相则是可以溶解样品组分的溶剂。被测样品组分分子，通过在流动相的大量溶剂与色谱柱中多孔填料固定相之间反复交换，从而达到按分子量大小的顺序进行分离，大分子量的样品组分先从色谱柱中洗脱出来，而小分子量的样品组分则后从色谱柱中洗脱出来。

第109页：五、制备高效液相色谱

• 五、制备高效液相色谱法（一）分离条件的选择以分析型HPLC作为选择分离条件的起点，固定相相同，粒径较大(20~40μm)。流动相采用等溶剂强度洗脱。为了维持与分析型HPLC相似的保留时间，必须增大流动相的流量，一般原则为流量之比是柱内径之比的平方。

第110页：（二）上样量的影响

（二）上样量的影响制备型HPLC常在超载条件下工作，但超载常常影响分离效能。在实际操作过程中，制备柱的上样量如果按分析柱上样量放大，一般不会影响分离效能；上样量过大质量超载，会出现拖尾峰，而保留时间发生变化；样品浓度稀，上样体积过大，但质量不超载，则出现平头峰，其半峰宽等于柱头样品宽度；样品体积与质量都超载，则产生两者的综合影响。

第111页：超载类型

不超载样品体积超载质量超载样品体积与质量都超载

第112页：（三）检测器的选择

（三）检测器的选择低灵敏度的检测器即可，但要求检测器的线性响应范围要宽，而且要求对被分离样品组分是非破坏性的，才能达到制备的要求。（四）分离样品组分收集被分离样品组分的收集是通过手动或自动馏分收集器进行的。

第113页：制备色谱的三要素

分辨率载样量分离速度

第114页：六、直接进样分析

• 六、直接进样分析法（一）直接进样与沉淀蛋白进样1.只要被测样品组分不经浓集就能达到足够的检测灵敏度，而且在流动相中引人较多体液水份，对被测样品组分的色谱分离及色谱系统无影响，就可采用直接进样法。2.直接进样分析法最适合尿样的分析，因为正常尿液中含有极微量的蛋白质，不会污染堵塞色谱柱。

第115页：（一）除去蛋白后进样

• 3.除去蛋白后进样除去蛋白通常采用沉淀法，即在体液样品中加入沉淀剂如甲醇、乙腈及三氯醋酸等，使蛋白质沉淀，取上清样品液进样。此法虽然快速、简便，但加入的沉淀剂也会带来不良影响。4.被测样品中的药物或代谢物极性很大，又难于用有机溶剂自样品中萃取出来时，就适合采用上述的方法。

第116页：（二）柱切换技术

（二）柱切换技术柱切换技术是指能用阀来改变流动相走向及流动相系统，使洗脱液在特定时间内从预处理柱切换到分析柱上的一种技术。

第117页：

第118页：柱切换HPLC的主要优点

柱切换HPLC的主要优点：（1）样品前处理简单且自动化操作（2）被测样品组分富集提高了监测的灵敏度（3）精密度高

第119页：（三）胶束色谱用含有高于临界胶束浓度

（三）胶束色谱用含有高于临界胶束浓度的表面活性剂溶液作为流动相。

第120页：胶束溶液的特性

胶束溶液的特性：在高于临界胶束浓度的一个很大的范围内，溶液中表面活性剂量的增加，胶束个数增加，大小不变，而分子单体浓度不增加，溶液的某些物理性质（表面张力、电导等）不变。其物理性质具有热稳定性。

第121页：胶束的类型

类型：正相胶束溶液：在极性溶剂中形成，亲水端在外，亲脂端在内的胶束溶液。体内药物分析常用此胶束溶液。反相胶束溶液，在非极性溶剂中形成的亲脂端在外，亲水端在内的胶束溶液。

第122页：两种类型的胶束

两种类型的胶束图

第123页：胶束色谱的原理

• 1.原理胶束溶液是非均相体系：固定相、水相和胶束。被分离组分在三相之间分配，受到静电增溶、疏水及空间效应等综合作用，能获得一般液相色谱达不到的分离效果。当改变胶束的类型、浓度、电荷性质等，则对被分离组分的色谱行为、淋洗次序、分离效果均有较大影响。特别适用于样品组成复杂，组分结构类似、性质差别不大的体内药物及其代谢物的分析。

第124页：溶质在三相中的分配

溶质在三相中的分配

第125页：常用表面活性剂

• 2.常用的表面活性剂用于正相胶束色谱：阴离子型：十二烷基硫酸钠（R-OSO3Na，SDSt），CMC为0.0081 mol/L，当小于CMC时为离子对色谱用流动相。十二烷基磺酸钠（R-SO2Na，SDSn）CMC为0.0097 mol/L。

第126页：阳离子型表面活性剂

阳离子型有：溴化十六烷基三甲铵(C16H33N(CH3)3Br，CTAB)，CMC为0.0013mol/L。由于这类表面活性剂易使蛋白质变性，不用于直接进样法，常用于离子对色谱。非离子型有：十二烷基聚乙二醇，（C12-(OC2H4)23OH），CMC为0.0001 mol/L。两性型有：N,N－二甲基－N（羧甲基）辛铵盐（C8H17N+(CH3)2·CH2COO-）。

第127页：胶束色谱的特点

• 3.胶束色谱的特点胶束色谱与传统液相色谱最大的区别流动相是非均相体系。1)高度的选择性，2)有利于梯度洗脱，改变流动相中胶束浓度即可。不影响平衡过程，基线噪音小，3)提高了检测灵敏度，4)使体液样品直接进样成为可能，5)流动相组成简单，安全、经济，废液好处理。不足之处是不能用于制备。

第128页：（一）反相离子对色谱

（一）反相离子对色谱测定人血浆中芬太尼浓度1．色谱条件色谱柱为Bondapak C18；流动相为水（含0.005mol/L辛烷磺酸钠，0.01mol／L磷酸）-乙腈（69：31）；流速为1.0ml/min；检测波长为220nm；柱温为室温。八、应用示例

第129页：样品预处理

• 2．样品预处理取肝素抗凝抗血浆1.0ml于具塞试管中，准确加入20μl内标液，混匀。加1mol/L NaOH溶液0.5ml，正己烷－乙醇(20：1)提取剂5ml，混合，涡旋3min，进行振荡提取，离心，取上层有机相于另一尖底试管中，在50℃水浴中氮气流下吹干，以50μl流动相溶解残渣，取30μl进样分析。

第130页：标准曲线的绘制

• 3．标准曲线的绘制4．回收率试验

第131页：精密度试验

• 5．精密度试验

第132页：（二）柱切换HPLC法直接测定

（二）柱切换HPLC法直接测定人尿中咖啡因的含量1．色谱条件色谱仪配六通柱切换阀；二极管阵列检测器，检测波长为275nm；保护柱为ODS(C18，22mm×2.1mm，5μm)；分析柱为ODS (C18，200mm×4.6mm，5μm)；流动相A为水，B为乙腈；梯度条件为保护柱为0～3.5min：0％B，3.5lmin：切换柱；分析柱为3.51～13.0 min：5％～25％B，13～16min：25％～65％B。

第133页：标准曲线的绘制

• 2．标准曲线的绘制3．回收率试验计算峰面积，得出该方法的回收率分别为98.2±0.75％(n=5)和98.7±0.62％(n=5)。

第134页：精密度

• 4．精密度

第135页：样品测定结果与提取法的比较

• 5．样品测定结果及与提取方法的比较

第136页：