03 第三章 生物样品与样品制备.pptx

第1页：第三章生物样品与样品制备

第三章生物样品与样品制备

第2页：内容提要

内容提要第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存第二节生物样品的预处理与制备

第3页：第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存

第一节生物样品的种类、采集、制备与贮存

第4页：一、生物样品的种类

• 一、生物样品的种类、采集和制备

血液（血浆、血清）－体现药物浓度和治疗作用之间的关系，为最常用的生物样本 尿液－用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等研究测定 唾液－用于某些S/P较为恒定的药物的测定。 毛发－可用于药物滥用监测及微量元素测定 肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织－动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡。

第5页：（一）血液

（一）血液（blood） 血液的基本组成和血量组成：血浆+血细胞血量（blood volume）：人体内血浆和血细胞的总和，约占人体重量的7~8%。例：体重为60kg的人，血量约5L。

第6页：循环血量

循环血量（circulationg blood）：大部分在心血管中迅速流动。贮备血量（reservoir blood）：“滞留”肝、肺、腹腔静脉及皮下动脉，流动较慢。

第7页：血浆的化学成分

血浆的化学成分基本成分:晶体物质溶液（多种电解质、小分子有机物、气体），易透过毛细血管与组织液交换，含量与组织液基本相同。血浆蛋白：血浆中各种蛋白质的总称，不能透过毛细血管，用盐析法可分为三类：白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原。血浆与组织液的区别：主要是蛋白质含量不同

第8页：

第9页：（一）血液（续）

（一）血液（blood）因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品－分为全血、血浆和血清。1．血样的采集一般用注射器直接采集静脉血，每次1～5ml，动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。

第10页：血样的制备

• 2．血样的制备测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。血样的应用：药物动力学；生物利用度；临床治疗药物浓度监测

第11页：血浆的制备

血浆的制备：采集后的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，在2500～3000rpm离心5～10min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆（plasma），量约为全血的一半。抗凝剂：最常用的是肝素（heparin），其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等。

第12页：血清的制备

血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min～1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在2500～3000rpm离心5～10min，上层淡黄色液体即为血清（serum）

第13页：血浆与血清的区别

血浆与血清的区别：血清比血浆只是少了一种纤维蛋白原，其浓度一致，血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50％～60％（血清为全血的20％～40％），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。

第14页：血浆与血清的制备方法

血浆与血清的比较 不同之处：1.制备方法2.制取量3.纤维蛋白4.分离速度 相同之处：1. C血浆＝C血清2.分析方法相同3.测得的都是总浓度

第15页：牛奶与氢氧化铝凝胶对去甲金霉素的影响

全血的制备：将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血”（whole blood）。全血除含有血浆外还有一些有形物质（红细胞、白细胞和血小板），净化较血浆和血清麻烦。

第16页：全血样品的适用情形

血浆浓度低 血浆和红细胞中分配比不是常数。如三环类降压药在个别病人体内血浆和红血球中的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究。

第17页：血样的特点

血样的特点 优点：较好地体现药物浓度与治疗作用之间的关系 缺点：属于损伤性取样方式取样量有限抽血需要专业人士

第18页：（二）唾液

（二）唾液（saliva）1.来源：三对唾液腺（腮腺、颌下腺、舌下腺）2.性质、成分：中性、无色、无味水分：99%有机物：粘蛋白、球蛋白、淀粉酶、溶菌酶pH范围为6.2～7.4

第19页：唾液的采集

采集在漱口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样（需注意干扰）物理法：口嚼石蜡片，聚四氟乙烯块或纱布球。化学法：将柠檬酸或维生素C等置于舌尖，弃取初始部分后采集。

第20页：化学刺激法的优点

化学法的优点：缩短采样时间减少唾液pH波动（pH≈7.0）S/P个体差异小。维生素C刺激法采集唾液测不到安定。

第21页：唾液药物浓度与血浆游离药物浓度的相关性

一些药物的唾液药物浓度（S）与血浆游离药物浓度（P）密切相关，可使用唾液样品。唾液样品的应用： STDM－如苯妥英钠的CS/CP比值恒定、个体差异小，可用于癫痫病人的TDM； 药代动力学参数测定－用GC-MS分析测定可卡因，血浆或唾液中的t1/2分别为3.8h和7.9h。

第22页：唾液样品的特点

唾液特点： 优点：非伤害性方法采集，病人易接受；采集不受时间、地点限制，易收集；CS/CP比值较恒定时，可代替血样进行TDM及药代动力学研究 缺点：适用药物较少取样量变化较大

第23页：（三）尿液

（三）尿液（urine）尿液用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原形、I相及II相代谢物等多种形式排出性状－淡黄色或黄褐色，相对密度1.105 ~ 1.020,pH4.8 ~ 8.0成分－水、含氮化合物、盐类等微生物－防腐剂

第24页：尿液的采集

尿液的采集样本来源：自然排尿，成人一日排尿量为1～5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿）。样本采集：一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量）

第25页：尿样的特点

尿样的特点 优点：属于非损伤性取样方式药物浓度高收集方便 缺点：浓度变化大，与血药浓度相关性差不易采集完全及保存肾功能不良者及婴儿不宜采用

第26页：（四）器官组织

（四）器官组织（tissue）用于动物试验药物动力学研究及临床服用药物引起中毒死亡。器官组织均匀化处理的一般方法有：1．匀浆化法加入一定量的水和缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用。特点－方法简单、但回收率低。

第27页：沉淀蛋白法

• 2．沉淀蛋白法在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用。3．酸水解或碱水解组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴上加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用。适用于对热稳定的药物，应用较少。

第28页：酶水解法

• 4.酶水解法组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用最常用的酶－枯草菌溶酶（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.0～11.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在50～60℃具有最大活力）优点：酶解法操作简便；避免药物在酸及高温下降解；对与蛋白结合紧密的药物，可显著改善回收率；可用有机溶剂直接萃取酶解液而无乳化现象生成缺点：不适用于在碱性条件下易水解的药物。

第29页：（五）头发

（五）头发（hair）应用－体内微量元素含量测定－用于用药史的估计－临床用药和药物非法滥用的区别、毒性药物检测。

第30页：头发检测的特点

头发检测的性质：广谱性（代谢产物及微量元素的排泄器官）积累性（长期富集各代谢产物）稳定性（水分含量少）依时性（反映某时期药物的积累）相关性（与人体内部器官相关）指纹性（环境、饮食等）

第31页：头发的采集与洗涤

头发的采集与洗涤采集：代表性和同一性;采集枕部发样（微量元素在前额部位的头发中含量最低，枕部含量最高）。洗涤：除去外源性污染物。

第32页：毛发中药物的常用提取方法

毛发样品的制备1．毛发中药物的常用提取方法直接用甲醇提取；酸水解（0.1mol/l）碱水解（1mol/l氢氧化钠）；酶水解（β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶）。2．有机破坏法

第33页：头发样品的优缺点

优点：取样方便、可重复取样；通过测定某些特定的代谢物将药物滥用和临床用药相区别；能获数月至数年的长期用药信息。缺点：预处理繁杂、干扰多；分析对象的含量低、需精密仪器。

第34页：非均匀生物样品辨析题

1. 属于非均匀生物样品的是（）

• A. 肝
• B. 血液
• C. 唾液
• D. 尿液
• E. 头发

第35页：最常采用的生物样本辨析题

2. 体内药物分析最常采用的样本是什么（）

• A. 血清
• B. 血浆
• C. 尿液
• D. 唾液
• E. 全血

第36页：血浆与血清辨析题

3. 关于血浆与血清，下面说法正确的有（）

• A. 血清比血浆少了纤维蛋白原
• B. 血浆比血清少了纤维蛋白原
• C. 血清制取量为全血的50％～60％
• D. 浓度不同
• E. 血浆中含有抗凝剂

第37页：全血样品辨析题

4. 关于全血，下面说法正确的有（）

• A. 净化较血浆与血清麻烦
• B. 不经离心操作
• C. 加了抗凝剂
• D. 血浆药物浓度低时宜采用全血
• E. 药物在血浆和红血球中的分配比不是一个常数时宜采用全血

第38页：尿液按时间划分辨析题

5. 尿液按时间可划分为下列几种，进行尿药浓度测定时，采用哪种作为样品（）

• A. 随时尿
• B. 晨尿
• C. 白天尿
• D. 夜间尿
• E. 时间尿

第39页：唾液样品适用范围辨析题

6. 在什么情况下，可以使用唾液样品进行临床药物监测（）

• A. 唾液药物浓度（S）与血浆游离药物浓度（P）密切相关的药物，
• B. 蛋白结合率较高的药物
• C. 蛋白结合率较低的药物
• D. 离解度随pH变化的药物
• E. 癫痫病人

第40页：器官组织均匀化处理方法辨析题

7. 器官组织均匀化处理的一般方法有：（）

• A. 匀浆化法
• B. 沉淀蛋白法
• C. 酸水解或碱水解
• D. 酶水解法
• E. 有机破坏法

第41页：头发检测性质辨析题

8. 头发检测具有哪些性质（）

• A. 广谱性
• B. 积累性
• C. 稳定性
• D. 依时性
• E. 相关性和指纹性

第42页：二、生物样品的贮存与处理冷藏

• 二、生物样品的贮存与处理冷藏：冰箱（4℃）中短期保存（1～2d）冷冻：冷柜（-20℃）或低温冷柜（-80℃）中长期保存。冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定。

第43页：血样的储存

生物样品的储存血样采集后及时分离血浆和血清（＜2h）分离后，置硬质玻璃试管中完全密塞后保存。若不预先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。

第44页：尿样的储存与处理

尿样采集后立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存。常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等。甲苯在尿液表面形成薄膜，醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长。保存时间为24～36h（4℃）或长期（-20℃）

第45页：唾液样品的储存

唾液为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存；保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好；冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差。

第46页：冷冻样品的处理

注意事项：1.冷冻的样品测定时，需临时解冻。解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻融。2.如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定。

第47页：第二节生物样品的预处理与制备

第二节生物样品的预处理与制备

第48页：样品预处理技术

样品预处理技术：分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件。样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作。对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取适当的方法和技术。

第49页：一、生物样品预处理的目

• 一、生物样品预处理的目的（一）使药物从缀合物及结合物中释放－测定药物的总浓度药物在体内存在形式：游离型药物代谢物药物或代谢物与蛋白结合物药物或代谢物与内源性物质结合的缀合物预处理使药物或代谢物从“结合物”或“缀合物”中释放，测定药物或代谢物的总浓度。

第50页：（二）生物样品介质组成的复杂性

（二）生物样品介质组成复杂、干扰多，而药物组分是微量的，预处理可使之纯化、富集如：血清：高分子的蛋白质、低分子的糖、脂肪、尿素等有机物，钠盐、钾盐、氯离子等无机物；尿液：尿素、肌酸、尿囊素、氨、钠盐、钾盐、氯离子等；药物含量低，一般为μg或ng水平。

第51页：（三）提高检测灵敏度－适应和符合测定

（三）提高检测灵敏度－适应和符合测定方法要求的灵敏度预处理的目的：降低背景噪音；提高灵敏度特异性强、灵敏度高的分析方法－预处理简单不具备分离功能的方法（光谱法）－预处理十分重要。

第52页：（四）防止分析仪器的污染

（四）防止分析仪器的污染和劣化－提高分析仪器的耐受程度，改善分析结果。生物样品基质中脂肪、蛋白质、不溶性颗粒污染分析仪器；根据分析仪器的耐受程度，选择不同的预处理方法。

第53页：HPLC法预处理示例

例：高效液相色谱法预处理－改善分析结果的准确度与精密度－延长色谱柱的寿命（除去固体杂质）－改善选择性（排除生物基质的干扰）－改善组分可测定性（被测组分的富集）－改善组分色谱行为（化学衍生化）

第54页：二、样品制备时应考虑的问题

• 二、样品制备时应考虑的问题1．被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围2．测定目的3．生物样品种类和基质的干扰类型4．样品的化学组成5．药物的蛋白结合率6．被测组分在预处理过程中的稳定性7．样品在收集、储存和预处理中容器的污染8．保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单

第55页：药物的理化性质

• 1.药物的理化性质和存在形式酸碱性（pKa）溶解性－提取性质挥发性－挥发损失及气相色谱法的应用光谱特性－分析仪器的选择官能团性质－化学衍生化和检测器的应用化学稳定性－处理条件的选择存在形式及血浆蛋白结合率－预处理方法

第56页：待测药物的浓度

• 2.待测药物的浓度范围不同药物在体内的浓度相差极为悬殊如：地高辛治疗血药浓度为1～2ng/ml水杨酸盐治疗血药浓度为20～100ug/ml浓度大－预处理要求稍低浓度低－样品制备要求高

第57页：药物测定的目的与要求

• 3.药物测定的目的目的不同，样品预处理要求就不同：例如：急性中毒病例：要求快速鉴定所怀疑的药物，对样品预处理的要求可以粗放些。测定药物及代谢物：要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致。

第58页：选用的生物样品

• 4.选用的生物样品类型样品类型决定预处理方法：血浆、血清－除去蛋白质唾液－离心沉淀除去粘蛋白尿液－采用酸或酶法使缀合物水解头发－有机破坏后测定微量元素

第59页：样品预处理与分析技术的关系

• 5.样品预处理与分析技术的关系（1）分析方法特点（是否专属、是否具有分离能力）（2）检测系统对杂质污染的耐受程度决定样品预处理和需要净化的程度。

第60页：三、生物样品的预处理与制备

• 三、生物样品的预处理与制备技术生物样品的预处理大致可分为以下5类：1.有机破坏法2.去除蛋白法3.溶剂萃取法4.缀合物的水解5.化学衍生化法

第61页：（一）有机破坏法

（一）有机破坏法应用：微量元素测定方法：1.湿法破坏2.干法破坏3.氧瓶燃烧法

第62页：湿法破坏

• 1.湿法破坏常用试剂：硝酸或硝酸-高氯酸特点：破坏能力强，反应激烈，无机金属离子为高价态应用：适用于血、尿、组织等生物样品的破坏缺点：含氮杂环药物的破坏不够完全注意：切勿蒸干、以免爆炸样品用量：金属元素量10～100ug，血样10～15ml、尿样50ml

第63页：干法破坏

• 2.干法破坏高温炉高温破坏应用：适合人发样品的破坏

第64页：氧瓶燃烧法

• 3.氧瓶燃烧（Oxygen flask combustion）特点：操作简单、快速、设备简单，应用：血浆、人发中卤素、硫、硒等取样方法：血浆：血浆1ml分次点在无灰滤纸上→60℃烘干→按规定折叠后固定人发：洗净、干燥（60～80℃）→剪碎→称取0.1～0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠后固定

第65页：（二）去除蛋白质

（二）去除蛋白质1.可使结合型药物释放2.预防提取时蛋白质发泡，减少乳化的形成3.可以保护仪器性能，延长使用期限

第66页：加入与水相混溶的有机溶剂

去除蛋白质的方法：1.加入与水相混溶的有机溶剂2.加入中性盐3.加入强酸4.加入重金属盐5.超滤法6.酶水解法7.加热法

第67页：加入与水相混溶的有机溶剂（续）

• 1.加入与水相混溶的有机溶剂原理：使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃试剂用量：血样与溶剂体积比为1︰1～3操作：有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。注意采用超速离心（12000rpm）分离1～2min

第68页：加入中性盐

• 2.加入中性盐原理：中性盐使蛋白质脱水而沉淀常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量：血清与饱和硫酸铵比例为1︰2操作：血清与中性盐按一定比例混合后超速离心（10000rpm）分离1～2min，取上清液作为样品。上清液pH 7.0～7.7。

第69页：加入强酸

• 3.加入强酸原理：强酸与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。常用：10％三氯醋酸、6％高氯酸、5％偏磷酸等。操作：血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心（10000rpm）1～2min，即可。上清液pH 0～4，不适于酸性下分解的药物。过量酸的排除：过量三氯醋酸可通过煮沸或乙醚提取除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀被除去。

第70页：加入含锌盐及铜盐的沉淀剂

• 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂原理：当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。常用沉淀剂：CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH血清与沉淀剂比例：1︰1～30分离：高速（10000rpm）离心

第71页：超滤法

• 5.超滤法性质：以多孔性半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。特点：无需加热；无需添加化学试剂；无相变化；无破坏性；样品量少；简便快捷，结果稳定可靠应用：游离药物首选方法，尤其适合TDM操作：分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了药物的血浆蛋白分离。

第72页：酶水解法加入适量的酶和缓冲液

• 6.酶水解法加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一段时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。优点：①平衡条件下进行，可避免反应和降解②可改善对蛋白结合率强的药物的回收率③不产生乳化

第73页：加热法

• 7.加热法测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀，加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去。优点：方法最简单；缺点：只能除去热变性蛋白。

第74页：（三）分离

（三）分离、纯化与浓集在生物样品的制备过程中，进行选择性分离、纯化与浓集分离－消除内源性物质、代谢物或其它共存药物的干扰；纯化与浓集－提高被测药物的灵敏度样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达到专属性强、灵敏度高、准确性好。

第75页：生物样品的分离、纯化方法液－液萃取法

生物样品的分离、纯化方法液－液萃取法（传统的方法）固相萃取法（液－固萃取法）自动化固相萃取技术固相微萃取膜萃取技术微透析技术超临界流体萃取法

第76页：液－液萃取法

• 1.液－液萃取法（Liquid-liquid extraction ,LLE）大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于水中，大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质，采用有机溶剂萃取法。

第77页：溶剂的极性

溶剂的极性：根据相似相溶原理选择，实际萃取时通常会加入第二种溶剂（醇类）调整极性，提高选择性。 溶剂的沸点：沸点低、易挥散，浓集； 溶剂的毒性：乙酸乙酯为最理想的溶剂 溶剂与水的互溶性：乙醚（1.2％水，用无水硫酸钠脱水）（1）溶剂选择

第78页：（2）有机溶剂萃取次数

• （2）有机溶剂萃取次数：通常为1次，必要时2～3次；（3）有机溶剂用量：与水体积比通常为1︰1或2︰1一般并不考虑“提尽药物”多采用提取前加入等量内标

第79页：萃取溶剂用量对回收率的影响

萃取溶剂用量对环戊基哌嗪利复霉素自血浆中萃取回收率的影响6.05.03.02.01.00.750.5乙酸乙酯用量9.1111214.415.514.13.7环戊基哌嗪利复霉素峰高

说明：源文件本页给出的溶剂用量与峰高数值未能一一对应（7个用量仅6个峰高值），无法安全还原为表格，此处按原文照录，建议对照原图补充。

第80页：（4）水相pH值

• （4）水相pH值：由药物的pKa确定：碱性药物：高于pKa值1～2个pH单位；酸性药物：低于pKa值1～2个pH单位。一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取。

第81页：提取时水相pH的选择

生物样品宜在碱性或近中性提取－生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取。

第82页：（5）其他方法

• （5）其他方法：离子对提取法（ion-pair extraction）提取烷基化法（extractive alkylation）－适用于离子化倾向较大，难以用溶剂直接提取的极性药物。

第83页：离子对提取法一种有机溶剂提取离子型药物方

离子对提取法一种有机溶剂提取离子型药物方法原理：在体液（水溶液）中呈离解状态的酸性或碱性有机药物（Q），与呈相反电荷离子（X）作用形成具有一定脂溶性的离子对（QX），再用有机溶剂提取。

第84页：离子对提取法：碱性药物示例

以碱性药物为例，反应式如下：DQ－分配系数，表示药物在有机相和水相中的摩尔浓度比，数值越大，提取到有机相中的药物量越多；DQ值的大小由提取常数EQX和水相中反离子浓度[X-]aq决定。

第85页：反离子的选择

反离子的选择测定碱性药物：用烷基磺酸盐（RSO3-），如戊～辛烷磺酸钠，月桂磺酸钠等测定酸性药物：用烷基季铵类化合物（R4N+·X-），如氢氧化四乙基铵，四丁基铵，四辛基铵等。常用的提取溶剂：对离子对溶解度较大的三氯甲烷、二氯甲烷等有机相与水相比例：1︰1或2︰1pH：选择合适的pH使药物与反离子均成离解状态

第86页：可用离子对法提取的药物

可用离子对法提取的药物：体液中呈阴离子状态的药物主要有磺酸类、羧酸类及代谢物葡萄糖醛酸苷等体液中能离解成阳离子的药物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物。例:皮质酮葡萄糖醛酸缀合物因含有羧基药物呈阴离子状态存在，与四戊基铵阳离子形成离子对，用三氯甲烷提纯。

第87页：萃取操作技术

• （6）萃取技术在具盖玻璃试管中进行萃取操作，提取可采用振荡器往复振荡提取和涡旋振荡提取

第88页：萃取中内源性物质的干扰

LLE的优点：1.与内源性物质、极性差别较大的代谢物分离2.简便

第89页：乳化的防止措施

LLE的缺点：1.易产生乳化问题措施：①轻缓振摇②萃取剂中加入少量NaCl③轻微乳化时，离心使分开④乳化严重时，置低温冰箱使水相快速冻凝，破坏乳化层，再融化后离心。

第90页：有机溶剂的挥散问题

LLE的缺点：2.有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利3.不适于萃取分离极性强的组分4.溶剂用量较大，需浓集5.不能自动化

第91页：固相萃取法

• 2.固相萃取法（Solid-phase extraction,SPE）原理：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质后，再用适当溶剂洗脱药物。

第92页：常用洗脱方式

常用洗脱方式：（1）药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱；（2）杂质与固定相的亲和力比药物强，药物被直接洗脱。

第93页：固定相选择原则

固定相选择原则：固定相与被测组分应具有相似的极性。亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）离子交换型

第94页：固相萃取的实验步骤

实验步骤：（以亲脂性键合相硅胶为例）第一步：用6～10倍体积甲醇润湿小柱，活化填料。第二步：用6～10倍体积水或适当的缓冲液冲洗小柱，除去残留的甲醇。第三步：加样，使样品经过小柱，弃取废液。第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质。通N2干燥固相。第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱分析物，收集洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析。

第95页：固相萃取的溶剂洗脱步骤

溶剂洗第一步：适当溶剂清洗柱子流出液弃去水溶液洗水或缓冲溶液洗流出液弃去组分被保留第二步：样品上柱流出液弃去冲洗杂质溶剂或缓冲溶液洗流出液弃去洗脱第三步：组分洗脱收集浓缩分析

第96页：血浆样品可直接上柱

注意事项：1.血浆样品可直接上柱；2.样品量0.1~2ml；3.流速1～2ml/min

第97页：固相萃取法的特点

方法特点:优点：引入杂质少，完全避免乳化的形成；在优化条件下有较高萃取率，重现性较好；萃取条件温和，适于挥发性及对热不稳定药物；使用的溶剂大多可与水混溶，易于自动化。缺点：价格昂贵，技术要求高，批－批之间有差异。

第98页：SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较SPE

SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较SPE－高提取率及高选择性、快速、简单，可自动化，应用较多。LLE－两相间分配平衡时间较长，萃取回收率及选择性随药物及萃取条件而变化沉淀蛋白法－快速简便、回收率高；待测物含量低时不适用。

第99页：自动化SPE技术

• 3.自动化SPE技术优点：节约时间，400个/小时，确保了较高的工作效率；减少了操作误差，提高准确度和精密度；安全性好，可避免人对有毒样品的接触。缺点：残留物对测定的影响；在采用连续测定时，要考虑样品理化性质的稳定性对测定的影响。

第100页：SPME的特点

SPME的特点：（1）集采样、萃取、浓缩、进样于一体，避免引入多步操作误差（2）无需萃取溶剂，样品量小、空白值小（3）萃取选择性高（4）纤维涂层（萃取头）可重复用上百次（5）适用于分析挥发性和非挥发性物质（6）与GC及HPLC、MS等联用，自动化分析目前SPME使用的固相涂层种类限制了它的应用，但该法极具前途。

第101页：微透析技术

• 6.微透析技术（Microdialysis,MD）属于一种膜分离技术。利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续取样的新型采样和色谱样品制备技术。微透析技术可以用来研究生物体在活动时体液组成的一些变化。

第102页：微透析技术的原理

MD的原理：用与细胞间液非常接近的生理溶液以慢速度（0.5～5ul/min）灌注由膜制成的微透析探针（置于需要取样的部位），膜内外待测组分的浓度梯度使其由膜外（生物体内）进入膜内（探针内），随灌注液（透析液）流出体外，进入仪器分析系统如毛细管电泳、微柱HPLC。

第103页：

第104页：微透析技术的特点

微透析技术是对清醒、自由活动动物的在体取样，具有以下的显著特点： 时间分辨性－可连续跟踪体内药量随时间的变化 空间分辨性－取样真实代表取样位点目标化合物的浓度； 同时取样－不同部位同时植入探针研究目标化合物的体内分布； 目标分辨性－提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物，对药物研究具有重要意义； 不需处理－因样品不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定。

第105页：微透析在药物分布研究中的应用

MD的应用1.药物分布研究－勿需处死动物，可获得完整的浓度－时间资料；2.药物代谢研究－可获得药物代谢中间过程的信息；3.药代动力学研究－勿需采血，避免因血容量减少对药物分布及消除的影响，药动学资料更准确。 分析方法－色谱、GC-MS、LC-MS联用。

第106页：（四）缀合物的水解

（四）缀合物的水解（Hydrolysis of Conjugate）缀合物：药物或其代谢物与体内的内源性物质（葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱苷肽等）结合生成的产物。测定尿液中药物总量时需先行水解－从缀合物中释放药物。

第107页：酸水解

缀合物的水解方法1.酸水解－使用盐酸，该法比较简便、快速；与酶水解相比专一性较差、有些药物在酸水解时易分解2.酶水解－专一性较强、药物无分解；时间长、费用大，异性蛋白对于遇酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法。

第108页：酶水解

酶水解常用酶：葡糖苷酸酶（Glucuronidase）硫酸酯酶（Sulfatase）最常用的是两种的混合酶水解条件：溶液pH值4.5～5.5，37℃培育数小时。

第109页：溶剂解

• 3.溶剂解缀合物（主要是硫酸酯）在萃取过程中可被加入的溶剂分解称为溶剂解。尿中的甾体硫酸酯在pH1时加醋酸乙酯提取。产生溶剂解。目前对缀合物的分析，逐渐趋向于直接测定缀合物的含量。

第110页：例：血、尿中三唑仑代谢物的GC测定三唑仑

例：血、尿中三唑仑代谢物的GC测定三唑仑α－羟基三唑仑4－羟基三唑仑

第111页：三唑仑代谢物测定的酸水解

酸水解：尿中缀合物用盐酸水解时，使代谢物的七元环断裂、形成相应的二苯甲酮衍生物。酶水解：用β-葡萄糖醛酸苷酶水解酶尿液1ml、pH4. 8缓冲液50ul、β-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1ml、37℃水浴水解12h，水解后尿样调成pH9萃取。×

第112页：（五）化学衍生化

（五）化学衍生化1.光谱衍生化紫外紫外分光光度法荧光分析法2．色谱衍生化分析法某些药物或代谢物极性大、挥发性低，对热不稳定或对检测器不够灵敏，就要进行衍生化。药物分子中含有活泼氢者（R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R’）均可被化学衍生化而应用GC、HPLC分析。

第113页：GC化学衍生化的目的

• （1）GC－化学衍生化GC－化学衍生化目的：1.使极性药物变成非极性、易挥发药物；2.增加药物稳定性；3.为提高对光学异构体的分离能力。

第114页：GC－衍生化反应类型

GC－衍生化反应类型：烷基化（Alkylations）酰化（Acylations）硅烷化（Silylations）非对映体衍生化（to produce diastereomers）

第115页：硅烷化

硅烷化：三甲基硅烷化试剂－取代药物分子中活泼氢原子，而使药物生成三甲基硅烷化衍生物，生成具有一定稳定性和挥发性的衍生物。常用的三甲基硅烷化试剂：三甲基氯硅烷（TMCS）；双－三甲基硅烷乙酰胺（BSA）；双－三甲基三氟乙酰胺（BSTFA）；三甲基硅咪唑（TMSI）。

第116页：酰化

酰化：用于含R-OH、R-NH2、R-NH-R’等极性基团的药物（心得安、利多卡因）。酰化后的药物具有更高的挥发性。常用试剂：三氟乙酸酐（TFAA）五氟乙酸酐（PFPA）五氟苯甲酰氯（PFBC）

第117页：烷基化

烷基化：用于含R-OH、R-COOH、R-NH-R’等极性基团药物，其活泼氢被烷基取代，生成烷基化衍生物，降低了化合物极性。常用试剂：碘庚烷（C7H15I）叠氮甲烷（CH2N2）氢氧化三甲基苯胺（TMAH）

第118页：GC化学衍生化的应用

GC－化学衍生化应用：扑热息痛的衍生化反应前体药物非那西丁，在体内代谢脱烷基氧化生成扑热息痛，可以利用烷基化、酯化或硅烷化等衍生化反应，测定扑热息痛的血药浓度。

第119页：非那西丁在体内的I相和II相代谢反应

非那西丁在体内的I相和II相代谢反应

第120页：HPLC化学衍生化

HPLC－化学衍生化目的：1.扩大HPLC法应用范围；2.提高对样品的检测灵敏度；3.改善样品混合物的分离度。（2）HPLC－化学衍生化

第121页：HPLC衍生化反应的要求

HPLC－化学衍生化反应要求：1.反应条件不苛刻、能迅速定量进行；2.生成单一衍生物、反应副产物（包括过量的衍生试剂）不干扰被测样品的分离和检测；3.衍生试剂方便易得、通用性好。

第122页：HPLC衍生化的分类

根据发生衍生化反应前后分为两类：1.柱前衍生法：在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。优点：衍生试剂、反应条件和时间的选择不受色谱系统的限制；衍生物易进一步纯化；不需附加仪器设备。缺点：操作过程较繁琐；易影响定量准确性。

第123页：柱后衍生法

• 2.柱后衍生法：在色谱分离后，色谱流出组分直接在系统中与衍生化试剂反应，在线检测衍生化产物。优点：操作简便，可连续反应，可自动化分析。缺点：对衍生试剂、反应条件和时间有限制；需附加仪器设备；导致色谱峰展宽。

第124页：紫外衍生化反应在紫外光区无吸收或吸收

• 1．紫外衍生化反应在紫外光区无吸收或吸收强度小的化合物不能被紫外检测器检测，与具有紫外吸收基团的衍生化试剂生成具有紫外吸收的衍生物，从而可以被紫外检测器检测。

第125页：荧光衍生化反应荧光检测

• 2．荧光衍生化反应荧光检测器具有高灵敏度、高选择性的特点，多数药物本身不具荧光，必须与荧光衍生化试剂反应，生成具有强荧光衍生物。如链霉素－荧光试剂茚三酮柱后衍生HPLC法测定。

第126页：电化学衍生化反应电化学检测

• 3．电化学衍生化反应电化学检测器灵敏度高、选择性强，如果被测药物没有电化学活性就不能被检测。电化学衍生化法是指药物与某些试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上被检测。

第127页：手性衍生化反应

• 4．手性衍生化反应：采用手性衍生化试剂将药物对映异构体转变为相应的非对映异构体，用常规非手性HPLC法进行分离分析。选用该法分离基于一下原因：不宜直接拆分－如游离胺类在手性固定相上呈弱的色谱性质，生成中性化合物则获显著改善；添加某些基团－增加色谱系统的对映异构选择性；提高紫外或荧光检测的效果。

第128页：手性衍生化反应的条件

手性衍生化反应的反应条件：溶质分子至少须有一个官能团供衍生；尽可能达到对映体纯，与溶质对映体反应无选择性；反应条件温和、简便，在溶质与衍生化试剂间无消旋化发生；产物非对映异构体应易于裂解为衍生前对映异构体。

第129页：伯胺和仲胺的衍生化试剂

手性衍生化试剂分类：1.伯胺和仲胺的衍生化试剂：0-甲基苯乙酰胺(-)-α-甲氧基-α-甲基-1-萘乙酸等；2.伯醇和仲醇的衍生化试剂：苄酯基-L-脯氨酸；双环己基碳化二亚胺和咪唑(+)/(-)-2-甲基-1,1’-双-萘基-2-羰基腈。3.羧基的衍生化试剂：R-(-)/S-(-)-α-甲基-对硝基苯胺草酰氯、二氨基丁醇和草酰氯

第130页：前处理方法的选择

具体处理某一样品时用什么前处理方法最好？从样品的种类、样品中待测物的浓度、待测物的稳定性、检测仪器的种类、待测物的检测方式等方面进行综合考虑

第131页：样品种类

阿齐霉素制剂生物等效性研究1.样品种类：血样2.阿齐霉素的血药浓度范围为5ng/ ml～1μg/ ml ,3.可采用检测方法：HPLC法，HPLC-MS法和微生物法等若用HPLC法来检测该样品，由于阿齐霉素的紫外吸收较弱，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处理方法采用液-液萃取法为佳；若用LC-MS法来检测该样品，则由于LC-MS仪器的灵敏度足以检测浓度为1ng/ml以上的样品，故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。

第132页：LC-MS检测阿齐霉素的样品处理

用LC-MS法来检测阿齐霉素时,也可用液-液萃取法、固相萃取法来处理血样。增加了样品处理的所需时间和工作量,而且增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血样处理最好采用蛋白沉淀法。蛋白沉淀法中高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法、考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。

第133页：血浆储存辨析题

关于血浆的储存，下面说法正确的有（）

• A. 短期保存在冰箱（4℃）
• B. 长期保存在冰箱（-20℃）
• C. 先分离后再贮存
• D. 冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定。
• E. 置硬质玻璃试管中完全密塞后保存

第134页：尿样储存辨析题

关于尿样的储存，下面说法正确的有（）

• A. 短期保存在冰箱（4℃）
• B. 长期保存在冰箱（-20℃）
• C. 保存需加防腐剂
• D. 甲苯为其常用防腐剂
• E. 氢氧化钠为其常用防腐剂

第135页：预处理要求最简单的测定方法辨析题

对生物样品预处理要求最简单的测定方法是：A. UVB. FluC. GCD. HPLCE. HPLC-MS

第136页：去除蛋白质的方法辨析题

去除蛋白质的方法包括（）

• A. 加入饱和硫酸铵
• B. 加入三氯醋酸
• C. 加入无水硫酸钠
• D. 酶水解法
• E. 加入乙腈