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本课件讲授免疫分析法：先说明抗原、抗体与抗原抗体反应的特点、免疫分析原理与基本条件，以及人工抗原制备与特异抗体制备；随后分别展开放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析与荧光免疫分析的原理、分离技术、标准曲线与应用示例。
第七章免疫分析法
第一节概述免疫分析法（Immunoassay，IA）是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法。
抗原(antigen, Ag)是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。
抗体：(antibody，Ab)机体是在抗原物质的刺激下形成的一类能与抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)，由细胞合成并分泌。抗体是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种免疫功能，主要存在于动物的血清、淋巴液、组织液及其它外分泌液中。
IgG分子由四条以二硫键相连的多肽链构成，有三个功能区。抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。
抗原-抗体反应(antigen-antibody reaction)抗原和对应抗体在一定条件下特异结合形成可逆性抗原-抗体复合物的过程。抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。
抗原抗体反应的基本类型与检测敏感度表：下表列出相关数据。
| 反应类型 | 实验技术 | 检测方法 | 敏感度 |
|---|---|---|---|
| 免疫标记技术 | 荧光免疫技术 | 检测荧光现象 | ++++ |
| 免疫标记技术 | 放射免疫技术 | 检测放射性 | ++++ |
| 免疫标记技术 | 酶标免疫技术 | 检测酶底物显色 | ++++ |
| 免疫标记技术 | 发光免疫技术 | 测定发光强度 | ++++ |
在实验条件下，抗原-抗体的反应常会受到结构相近似的其它药物或化合物的干扰，影响待测药物（抗原）与抗体的结合。这种干扰物与抗体的结合称为交叉反应（cross reaction）。交叉反应进行的程度越大，则免疫分析产生的误差也越大。
抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发生在分子的表面，并依靠抗原-抗体分子间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及范德华引力等而存在。这种结合具有相对稳定性，但仍为可逆反应。2.可逆性
免疫分析基于抗体与药物结合时所具有的专一性和可饱和性，利用被测药物同标记药物之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应值（如RIA中的放射性强度）之间的函数关系，用于体内药物分析。四、基本原理（一）竞争抑制原理
抗体（Ab）、标记抗原（标记药物，Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag）三种试剂是所有免疫分析必需的基本试剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的试剂。
三种试剂的作用分别是：1.抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白；2.标记药物提供可检测的信号（响应值）；3.非标记药物在标准曲线制备时是药物标准品，在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品中药物浓度计算的依据。
K2K1+Ag*
根据质量定律，当反应达到平衡时，反应可表示为：
抗原-抗体反应时，须满足以下条件：1. Ag*与Ag（待测物）必须是相同的生物活性物质；2.所加入Ag*和Ab的量应是固定的；3.Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点；4. Ag*、Ag及Ab须处在同一反应体系中。
标记抗原一抗体的结合率（B％）随着未标记抗原量（待测物）的增加而减少（呈负相关）。这种现象称作竞争抑制作用，即未标记抗原量的增加抑制了标记抗原与抗体的竞争性结合。
显然，在抗原抗体反应中，标记抗原-抗体结合物减少的程度取决于未标记抗原（被测物）的量，被测物的量越大，标记抗原与抗体的结合率就越小。这种竞争性抑制的数量关系就成为免疫分析的定量基础。
（二）竞争抑制曲线（或称剂量反应曲线）样品定量测定时，先用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液．再加入一定量的标记抗原和抗体，待抗原抗体反应达到平衡后，测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率。
以标准抗原Ag的浓度为横坐标，以结合率（B％）等为纵坐标绘制标准竞争曲线。然后取一定量样品，按同法操作，根据样品中标记抗原-抗体结合率，即可从标准曲线上查出相应的待测物的含量。
免疫原性（Immunogenicity）是指抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体。抗原特异性（Antigenic specificty）是指抗原能与特异抗体相作用的性质。
全抗原：指同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。作为全抗原的物质其分子量必须足够大（分子量>1000），且要求化学结构较复杂，如蛋白质、多肽等。
半抗原（Hapten）：指只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。人工抗原：药物(半抗原)本身不具免疫原性，只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原。人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
测定结合比的常用方法：（1）光谱分析法是利用结合物水解后，药物分子与蛋白质分子的紫外-可见吸收光谱、吸收系数或吸收比值的差异，分别测定水解药物和蛋白质的含量，从而推算出它们的分子结合比。
（二）特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体（Specific Antibody）特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高（约占70％），是免疫分析中最常用的抗体。
采血时应注意无菌操作，尽可能将血放入面积较大的无菌容器中，先室温凝固30min左右，再放入30℃温箱约2h使凝固，最后放入4℃冰箱过夜。次日吸取血清，将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎，在4000～10000r/min离心20min，即得抗血清。
抗血清滴度曲线从图中可见，抗血清A的滴度及它和标记抗原的亲和力较小，质量最差；B的滴度虽高，但亲和力不够高；C质量最佳，选其结合率50%稀释度，建立放射免疫分析方法最适宜。
第二节放射免疫分析放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）是利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术，为非均相免疫分析。
特点：灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备、放射性强度容易检测，特别适合复杂样品中微量或痕量物质的分析。
（二）标记抗原（Labeled Antigen）标记抗原又称放射性标记药物，供标记的药物通常应是待测药物的纯品。标记抗原的纯度决定RIA的特异性，而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度。因此，标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分。
125I的特点是：①化学性质活泼，易于标记；②标记物在衰变中放出的 -射线能量较高，易于测定；③标记物的放射线半衰期相对较短，须经常标记；④碘原子的半径较大，标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团，易使药物分子的抗原性受到影响。
3H的特点是：①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度；②标记后的药物的抗原性不会受到影响，因为氢原子的半径较小，且3H只是与药物分子的1H发生交换，不涉及化学元素的改变；③3H的半衰期很长，可达12～16年；④3H发射出的 射线能量较低，须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度。
（三）标记方法1.125I标记抗原的制备由于碘原子具有较高的化学活泼性，通常可用取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上。用碘标记时一般采用氧化法，常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等，目前应用最多的是氯胺T。
沉淀法的优点是快速、简便、价廉。缺点是不能使F和B完全分离，所形成的沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附，因而空白值较高。沉淀中是与抗体相结合的标记药物（B），而溶液中则是游离的标记药物（F）
（二）吸附法吸附法是利用固体吸附剂在反应液中能吸附游离抗原的原理而使F与B分离。常用的吸附剂有右旋糖酐包裹的活性炭（DCC)、纤维素、硅酸盐等。
上清液中是与抗体相结合的标记药物（B），而沉淀中则是游离的标记药物（F）吸附法的优点是快速、简便，缺点是如果药物-抗体结合物的离解常数较高时，测定结果不稳定。
（三）固相法固相法是通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面，待抗原与抗体形成结合物（B）后就附在固相物上，而游离的抗原（F）则仍留在反应液中，从而实行分离。
该法实质上是一种固相免疫测定法，其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂。固相法是当代免疫分析的研究热门，其优点是简便、快速、实用。缺点是有时难以获得重复的结合率，其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物，导致结果误差增大。
（四）双抗体法双抗体法是利用第二抗体（抗-抗体）沉淀在第一次抗体反应中所形成的可溶性抗原-抗体结合物。双抗体法是分离游离标记药物和结合标记药物的一种有效方法，其优点是分离效果好，适用范围广。缺点是抗体的制备有一定难度，且操作流程较长。
优点：分离效果好，适用范围广。缺点：抗体的制备有一定难度，且操作流程较长。沉淀中是与抗体相结合的标记药物（B），而溶液中则是游离的标记药物（F）
计数器，适合测定125I、131I等同位素发射出的能量较高的 -射线。另一类是液体闪烁测量仪，适合测定3H、14C等同位素发射出来的 -射线。
（一）标准曲线（或称剂量反应曲线）的绘制1.取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5～8个系列浓度。2.加入定量标记抗原，其总放射性（T）应能满足准确测量的需要。
标准曲线通常以标准抗原（待测药物标准品）的浓度为横坐标，以结合率（B％）为纵坐标作图。纵坐标B％的计算有两种方法：B％= (B/T)×100％B％=(B/B0)×100％B－抗体结合的标记药物的放射性强度T－加入的标记药物总放射性强度B0－零标准管（不加药物）的放射性强度
（二）样品测定样品测定步骤与上述标准曲线制备项下的操作基本相同。根据标准曲线或回归方程，便可求得样品中待测药物的浓度。
下述情况样品需进行简单处理：1.测定方法不够灵敏，可将被测物适当浓集；2.测定方法不很专属，可将被测物与其它干扰物质分离；3.待测物以缀合物形式存在，可设法使其游离，然后进行测定。
例：125I－RIA(DCC吸附法)测定血清中地高辛浓度待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线管50μl空白人血清→零标准管.→保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加入的125I总放射性剂量)→在电磁搅拌下，迅速向各管内加入1ml工作液，摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离125I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。
第三节酶免疫分析法酶免疫分析（Enzyme Immunoassay，EIA）是以酶作为标记物的免疫测定方法。该法与RIA的不同之处是用具有高效专一催化特性的标记酶代替了放射性同位素标记物。
酶免疫分析将抗原抗体特异反应和酶的高效催化作用有机结合，具有灵敏度高、特异性强、无放射性污染、操作简单、快速、易于掌握和易推广普及。目前已达到自动化、实用化、商品化的程度。广泛被用来测定体液中的药物和激素。
最常用的标记酶有：1.辣根过氧化物酶约有50％的EIA使用此酶。2.碱性磷酸酯酶3. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶通常用于均相4.β半乳糖苷酶适用于均相和非均相5.苹果酸脱氢酶多用于尿样的均相EIA
（二）底物的选择EIA的测定最后都是通过酶与底物反应所产生的颜色深浅来进行定量分析的。
合适的底物应具备以下条件：①无色、无毒能溶于水；②化学性质稳定、不受光照的影响；③转化率高，在酶催化下可产生大量的有色物质；④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比；⑤应有终止酶反应的试剂。
常用酶的底物：1.辣根过氧化物酶（HRP）的底物①邻苯二胺与酶反应后呈橙黄色，用2～4mol/LH2SO4终止反应，溶液呈棕黄色，可在1～2h内稳定不变，最大吸收峰是492nm。②5-氨基水杨酸与酶反应后呈棕色。用1％NaN3或3mol/L NaOH终止反应。最大吸收峰为449nm。③四甲基联苯胺及其硫酸盐经酶作用后呈蓝色，15～30min达高峰，用目测法观察结果。以1mol/LH2SO4终止反应后呈黄色（终止反应前呈蓝色），最大吸收峰为450nm。
-D-半乳糖苷酶底物4.葡萄糖氧化酶底物
（三）酶标药物的制备酶标药物制备方法选择的原则：①对酶和抗体的活性无影响或影响很小；②生成的结合物是可溶性的、稳定的；③反应条件容易控制，使生成的结合物适用于各种用途；④制备方法应简单、重复性好。
酶标药物的制备也可利用药物分子上的羟基、羧基、氨基、酚羟基等与标记酶分子上的氨基、羧基及其它基团相连接。
（一）测定原理
EMIT法通常使用6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD)作标记酶，其原理是标记在待测药物上的G-6-PD在辅酶I参与下能将底物6-磷酸葡萄糖(G-6-P)氧化成6-磷酸葡萄糖酸，而辅酶I本身则被还原成还原型辅酶I(NADH)。在该反应过程中，辅酶I的结构发生了变化，导致NAD与NADH的紫外吸收光谱形状不同，还原型辅酶I在340nm处有最大吸收，而辅酶I在此波长处则吸收甚小。
酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，当这种竞争结合反应达到平衡之后，则有部分酶标药物与抗体相结合，从而使结合酶标药物(AgE-Ab)上的酶活性受到抑制，不能再同底物发生作用，而只有游离酶标药物(AgE)上的酶才有活性，能作用于底物产生测定信号。如果样品中待测药物的浓度越高，则竞争抑制的结果使游离酶标药物的量增多，亦即酶的活性随着待测药物浓度的增加而增强，故有“酶增强免疫技术”之称。由于游离酶标药物量的增多，能使更多的NAD参与氧化反应，生成更多的酶反应产物NADH。根据NADH在340nm处有紫外吸收的原理，便可用分光光度计测定吸收度，求出待测药物的含量。
（一）测定原理
（二）测定步骤竞争法是将抗体直接吸附在有小孔的反应板孔内，然后将待测样品和定量的酶标药物加入孔内并混匀。将反应板置于适宜温度下温育一定时间，待酶标药物与未标记药物的竞争结合反应达到平衡后，洗去未同抗体结合的游离药物，而与抗体结合的酶标药物和未标记药物（固相载体沉淀部分）则保留在孔内。然后将底物加入孔内，结合在抗体上的酶标药物能催化底物，发生水解、氧化或还原等化学反应，从而产生可测信号。测定时以空白试验（孔内不加待测样品）作参比。
缺点：标记酶不像同位素标记物、荧光标记物那样能直接产生信号，而必须要何其它试剂，如酶底物、辅酶的参与，才能完成酶反应，引起吸收光谱等变化后方可进行测定。
第四节化学发光免疫分析化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是将化学发光反应（氧化反应）的高度灵敏性和免疫反应的高度专一性结合起来，用于测定超微量物质的一种检测技术。
化学发光反应多属于氧化反应。能产生化学发光反应的物质称为化学发光剂或化学发光底物。如果将化学发光物质直接标记在抗原或抗体上，或用酶作用于发光底物，即可进行化学发光免疫分析，根据免疫反应所产生的光信号强度，即可求得待测药物的含量。
（二）化学发光酶免疫分析法化学发光酶免疫分析法（Chemiluminescent EnzymyeImmunoassay，CLEIA）是以酶标物与抗原或抗体进行免疫反应，免疫反应结合物上的酶再作用于发光底物而发光，其发光强度可用发光信号测定仪进行测定。
化学发光免疫分析法具有发光反应的高灵敏性，又兼有免疫反应的特异性。对环境无污染，准确性、重复性较好，线性范围较宽，更适合定量分析。三、方法评价四、应用示例
第五节荧光免疫分析荧光免疫分析（FluorescenceImmunoassay，FIA）是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应，引起荧光强度发生变化的一种分析方法。
（二）常用荧光标记物荧光标记物最常用的是荧光素及其衍生物，其次是罗丹明。
F-DD+ AbF-D-AbD-AbF-D-AbF-D+酶无反应荧光产物标记反应：F + D → F-D竞争抑制反应：酶反应：
在上述反应中，同抗体结合的F-D-Ab，由于受抗体分子的空间位阻作用，阻碍了酶和标记底物之间的结合，因而无荧光产生。而呈游离状态的标记药物（F-D），由于底物能被相应酶催化裂解而发生化学结构变化，可产生荧光。SLFIA法属均相免疫反应，无需分离便可直接测定反应液中游离标记药物（F-D）的荧光强度，其荧光强度与样品中待测药物的浓度成正比。
（二）荧光偏振免疫分析荧光偏振免疫分析（FPIA）是用一定波长的激发偏振光照射荧光物质，然后利用物质吸收光能后所发射出的偏振荧光的强度来测定样品中待测组分含量的一种免疫分析方法。
DD-F+ Ab →D-AbD-F-Ab（偏振荧光弱）（偏振荧光强）
在FPIA中，利用未标记抗原对标记抗原的竞争抑制作用，随着未标记抗原浓度增加，标记抗原-抗体浓度降低，检测到的偏振荧光强度也相应降低，即被测药物浓度与偏振荧光强度成反比。
用垂直方向（ ex， ）和水平方向（ ex，‖）两种偏振光交替照射免疫反应液，而产生的荧光均通过垂直方向的检偏器后再检测。
当免疫反应液用 ex（ ）偏振光激发时，与抗体结合的标记药物（D-F-Ab）在垂直振动方向发射出很强的荧光（ em， ），而游离标记药物（D-F）发射出各向均等的普通荧光（ em，*），此时用垂直方向的检偏器检测到的总荧光F ，包括由D-F-Ab产生的偏振荧光Fa和D-F产生的垂直方向振动部分的荧光Fb。
当改用 ex（‖）激发时，D-F-Ab在水平振动方向发出很强的荧光（ em，‖），而D-F仍发出各向均等的普通荧光（ em，*），这时垂直方向的检偏器检测到的总荧光F‖，则仅为D-F发出的荧光（弱）。由于Fb=Fb/，因此，从用 ex（ ）照射测得的荧光强度F 中，减去用 ex（‖）照射时测得的荧光强度F‖，则可排除D-F微弱荧光的干扰，得到反应液中纯粹D-F-Ab发射出的偏振荧光强度。
Ag*Ag*-AbF||F⊥光源激发偏振片偏振光样品池荧光偏振片检测器
偏振度P是指结合标记药物（Ag-F-Ab）的偏振荧光强度占均相溶液中偏振荧光总强度的比例。可按下式计算：5.测定仪器FPIA法最有代表性的仪器是美国雅培公司生产的TDx快速血药浓度检测仪。
（三）荧光淬灭免疫分析荧光淬灭免疫分析（FQIA）是基于用一个荧光物质标记药物，当其与抗体结合之后失去荧光这一性质来测定样品含量的一种荧光分析方法。
在样品测定时，被测药物与标记药物竞争性的与抗体结合，被测药物多，标记药物就结合的少，因此荧光被猝灭的少，即荧光强度高。所以被测药物的浓度与荧光强度成正比，或者说被测药物浓度与荧光猝灭的程度成反比。
FQIA法测定的方便之处在于测定时无需分离，直接在荧光分光光度计上就可以读出荧光强度值F，但干扰较FPIA法大。
（四）荧光增强免疫分析荧光增强免疫分析（FEIA）是利用荧光标记药物与抗体结合之后，能使其荧光强度增强的性质来测定样品的含量。该法与荧光淬灭免疫分析相似，不同之处是与抗体结合后，不是使荧光淬灭，而是使荧光增强。
（五）时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是用镧系元素的螯合物作为标记物来标记抗原或抗体，用时间分辨技术来测量样品含量的一种新型荧光免疫分析方法。TRFIA法由于巧妙地利用了波长和时间分辨两种技术测量荧光，可有效地排除荧光免疫分析过程中本底荧光的干扰，而使测量方法的灵敏度和选择性明显提高。
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