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本课件讲解酶的催化共性与专一性、温和反应条件与易变失活等特性，系统推导米氏方程与拟稳态假设，介绍km与rmax的求取图解方法，并展开竞争性、非竞争性、反竞争性与混合型抑制动力学及酶的热失活动力学。
第四章 酶催化反应动力学：第四章酶催化反应动力学
酶的催化作用与化学本质：要点如下。
酶的催化共性：一、酶的催化共性酶参与生物化学反应，它能降低反应的活化能（分子参与化学反应时所需要的最低能量），加快生化反应的速率，但它不改变反应的方向和平衡关系，即它不能改变反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡的速率； 酶在反应过程中，其主体结构和离子价态可以发生某种变化，但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。
酶的催化特性：二、酶的催化特性（1）较高的催化效率（2）很强的专一性（3）具有温和的反应条件（4）易变性与失活
酶与化学催化剂转换数对比：酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较催化剂反应转换数mol/（中心点·S）温度℃酶催化剂菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶碳酸肝酶肽的水解肽的水解肽的水解羰基化合物的可逆反应4×10-3~5×10-18×10-2~1×103×10-3~1×1028×10-1~6×1050~370~370~370~37化学催化剂硅胶－氧化铝硅胶－氧化铝二氧化钒二氧化钒异丙基苯裂解异丙基苯裂解环己烷脱氢环己烷脱氢3×10-82×1047×10-111×1022542025350
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很强的专一性 酶催化反应有很高的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择性。
酶专一性的五种类型：绝对专一性：一种酶只能催化一种化合物进行一种反应相对专一性：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应反应专一性：一种酶只能催化某化合物在热力学上可能进行的许多反应中的一种反应底物专一性：一种酶只能催化一种底物立体专一性：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种
温和的反应条件：要点如下。
酶的易变性与失活：要点如下。
第二节简单的酶催化反应动力学 简单的酶催化反应动力学是指由一种反应物(底物)参与的不可逆反应。属于此类反应的有酶催化的水解反应和异构化反应。这种简单的单底物酶反应动力学，是酶反应动力学的基础。
米氏方程推导的三点假设：要点如下。
活性中间复合物学说：对酶催化反应过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物[ES]，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。 例如：酶反应其反应机理可表示为
反应速率的定义与表示：根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。 对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。 反应的速率可表示为rs：底物S的消耗速率（mol/L﹒s）rp：产物P生成速率（mol/L﹒s）v：反应体系的体积（L）ns、np：底物S和产物P的质量（mol）t：时间（s）
解离常数与酶总浓度：根据上述假定（3），可列出KS为解离常数（mol/l）反应体系中酶的总浓度为
米氏方程的表达式：代入得米氏方程或称M—M方程rp,max：P的最大生成速率[E0]：酶的总浓度，亦为酶的初始浓度
拟稳态假设：G．E．Briggs和J．B．Haldane对上述第三点假设进行修正，提出了“拟稳态”假设。 认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。 消去得km：米氏常数(mol/l)
km与ks的关系为由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。当<<时，km值才接近于ks
km值的意义：km是酶的特征性常数，测定km值具有重要的意义。 km值代表反应速率为最大反应速率一半时的基质浓度，其单位为浓度单位。
km值与酶底物亲和力：要点如下。
由km估计胞内基质浓度：根据km值，可以估计胞内基质浓度，如<<时，。 那么只要稍微改变基质浓度，的变化就很大，即反应速率对基质浓度改变的敏感性很大，如果或时，基质浓度相差1000倍，但反应速率只增加一倍，即在生理上保持>>是没有意义的。
最大反应速率rmax：要点如下。
反应速率曲线的三个区域：从~[S]图的关系曲线可以看出，该曲线表示了三个不同的动力学特点的区域。 当<<，即底物浓度比km值小很多时，该曲线近似为一条直线，这表示反应速率与底物浓度近似正比关系，此时酶催化反应可近似看作一级反应。 式中为总反应的一级反应常数。
一级反应区的特征：要点如下。
底物初始浓度的定义：：底物的初始浓度(mol/l)
一级反应积分式的形式：或其中
零级反应区的特征：要点如下。
米氏方程适用的中间区：当[S]与km的数量关系处于上述两者之间的范围时，则符合M—M方程所表示的关系式。
例4-1 一级反应底物转化：要点如下。
例4-1解 一级反应处理：解：（1）根据题意，﹤，此时一般可认为按一级反应处理，其动力学方程可表示为：时，∴mol/l
例4-1解 三分钟转化率：将已知数据代入上式中，求得min-1当t=3min时，可以求得mol/lxS=6%mol/l
例4-1解 低底物浓度情形：（2）当mol/l时，仍可视为一级反应，∴t=3min时，同样可求得xS=6 %mol/l mol/l
例4-1解 最大反应速率：（3）据得mol/l·min
酶动力学图解法概述：要点如下。
双倒数作图法：1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解）将M—M方程取其倒数得到下式:以值对应于作图：
双倒数法的两个缺点：双倒数法应用广泛，但有两个缺点：1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。 基质浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。 2、反应速率测定稍有误差，其倒数值误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响rmax及Km值的测定。
Hanes-Woolf作图法：2. 图解法（Hanes Woolf图解）将M—M方程变换成下式:以为纵坐标，为横坐标，此方程为一直线方程，直线斜率为，与纵轴交点为，与横轴交点为。
Woolf-Hofstee作图法：3. 图解法（Woolf-Augustinesson Hofstee图解）将M—M方程变换成下式:上式为直线方程式，r为纵坐标，为横坐标，直线的斜率为，与纵坐标交于，于横坐标交于，根据直线与两坐标的交点可求出及值，但在选用基质浓度时，也须注意，要在值的附近。
Eadle-Scatchard作图法：4. 图解法（Eadle Scatchard图解）将M—M方程变换成下式:此直线方程式，斜率为，与坐标交于，与r坐标交于。
Henri积分方程式：5. Henri Michaelis Menten积分方程式有时在酶反应过程中，基质或产物的浓度可以测得，但反应初速度则难以测定。 这时，就可选用积分方程式来测定酶的及值。
积分方程式的参数含义：式中：[S]为时间t时的基质浓度([S]0-[P]),([S]0-[P])为时间t内所用去的基质浓度，也为时间t内所生成的产物浓度[P]。 上式可改写为:上式也是直线方程式，斜率为，直线交点于纵坐标，与横坐标交于。
例 葡萄糖淀粉酶动力学参数：例4-1：在pH=5.1，15℃时测得葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的初速度为：5.558.3311.1113.6916.6622.2227.771.632.112.412.763.013.393.47试从测定结果求这个酶反应的和值。 解：从表S及r值，计算得及值，作图。 从连接各点所得的直线，求得
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第三节有抑制的酶催化反应动力学在酶催化反应中，由于某些外源化合物的存在而使反应速率下降，这种物质称为抑制剂。抑制作用分为可逆抑制与不可逆抑制两大类。如果某种抑制可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，则此类抑制称为可逆抑制，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。如果抑制剂与酶的基因成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如重金属离子Hg2+”、Pb2+”等对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制都是不可逆抑制。
可逆抑制的四种类型：要点如下。
一、竞争性抑制动力学若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。其主要特点是，抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。
竞争性抑制的机理式：要点如下。
竞争性抑制的米氏常数：经整理后可得KI—抑制剂的解离常数（mol/l）KmI—有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l）可以看出，竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变，rmax不受竞争性抑制剂的影响。 由于有抑制剂的存在，须有较高的基质浓度，才能维持一定的rmax值。
竞争性抑制程度的影响因素：要点如下。
竞争性抑制速率曲线：竞争性抑制的s-r关系图：
竞争性抑制双倒数方程：竞争性抑制的双倒数方程式或
竞争性抑制双倒数作图：以对作图，得一直线，其斜率为，与纵坐标的交点为，与横坐标的交点为。
KmI与[I]关系图求KI：又以KmI对[I]作图，据此图可求出Km和KI值竞争性抑制的KI与I关系图
抑制剂的解离常数由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，KmI与[I]的关系为一直线，可称为线型竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则与的关系为一抛物线，可称为抛物线型竞争抑制。
例4-2 竞争性抑制参数求解：要点如下。
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例4-2解 作图判别抑制类型：解：根据数据作图。 有抑制剂时，抑制作用为竞争性抑制
二、非竞争性抑制动力学若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。此时抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物ES相结合，生成了底物—酶—抑制剂的复合物SEI。绝大多数的情况是复合物SEI为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。还有一种是三元复合物SEI也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制属于非竞争性抑制。
非竞争性抑制的机理式：非竞争性抑制的普遍机理式可表示为
非竞争性抑制的最大速率：式中：为非竞争性抑制时的最大反应速率。
非竞争性抑制的抑制程度：对非竞争性抑制，由于抑制剂的作用使最大反应速率降低了倍，并且增加[I]、KI减小都使其抑制程度增加。 此时rSI对[S]的关系如图。
非竞争性抑制的L-B作图：根据L—B作图法，上式可整理成或以作图，可得一直线，并求出Km和rI,max值。
由rI,max确定KI：又根据式可通过实验测得不同[I]下rI,max的，进而确定KI值。
SEI能否分解产物的判别：要点如下。
竞争与非竞争性抑制的区别：要点如下。
例4-3 水杨酸抑制类型判别：要点如下。
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例4-3解 双作图求Km与KI：要点如下。
反竞争性抑制动力学：三、反竞争性抑制动力学反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成SEI复合物。
反竞争性抑制的速率方程：据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得其速率方程为式中：, ,
反竞争性抑制速率曲线：以rSI对[S]作图
反竞争性抑制L-B方程：据L—B作图法，方程为
反竞争性抑制的平行线特征：要点如下。
线性混合型抑制机理：四、线性混合型抑制动力学线形混合型的最简单机制可表示为：
线性混合型的解离常数修正：上式基本上与非竞争性抑制的模型相同，可不同的是，当EI与S结合生成SEI时，由于抑制剂的存在影响了EI与S的结合，因而其解离常数由KS变为，同样ES与I结合时，其解离常数由KI变为。
线性混合型的速率方程：上式中：根据上述机理式，可推出其速率方程为对此种抑制，式中为KS和KI的修正系数。 当，时，上述抑制实为非竞争性抑制。
四种抑制的普遍化机制：以上介绍了竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制及混合型抑制的动力学方程，虽然各具特点，但可用一普遍化的机制和公式来表示。 普遍化的机制可用下图表示：
普遍化机制的判别条件：要点如下。
当时，为非竞争性抑制；当时为竞争性抑制，当时为反竞争性抑制，当且均为常数值时，称为混合抑制。
例4-4 竞争与非竞争抑制比较：例4-4：某酶的Km值为4.7×10-5 mol/L ，如果rmax值为2.2×10-5mol/L·min，在底物浓度为2×10-4mol/L和在（1）竞争性抑制剂与（2）非竞争性抑制剂的浓度均为5×10-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？ 假定在上述情况下KI值均为3×10-4mol/L，则在上述两种抑制情况下的抑制程度各有多大？ 解：（1）对竞争性抑制，可列出下式
例4-4解 非竞争性抑制速率：（2）对非竞争性抑制，可列出下式mol/L·min（3）求抑制程度当无抑制剂存在时的反应速率为mol/L·min
例4-4解 抑制程度计算：所以上述两种抑制的抑制程度应分别为竞争性抑制非竞争性抑制
五．底物的抑制动力学有些酶催化反应，在底物浓度增加时，反应速率反而会下降，这种由底物浓度增大而引起反应速率下降的作用称为底物抑制作用。反应机理式为
底物抑制的动力学方程：SES为不具有催化反应活性，不能分解为产物的三元复合物。 应用稳态法处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学方程为其中：rSS为底物抑制的反应速率mol/l∙sKs为底物抑制的解离常数mol/l
最佳底物浓度的求取：要点如下。
可逆酶反应动力学：第四节复杂的酶催化反应动力学复杂的酶催化反应包括可逆反应、多底物反应和产物抑制等。 一、可逆酶反应动力学以最简单的单底物可逆酶反应为例，其反应机理可表示为若将生成P反应看作正反应，其速率为若将生成反应视为逆反应，其速率为
可逆反应的净速率式：反应的净速率则为根据稳态假设和物料平衡关系，并令KmP和KmS分别为正、逆反应的米氏常数。 rP,max和rS,max分别为正、逆反应的最大速率。
反应平衡常数Ke：反应的净速率式为若令：Ke为反应平衡常数，则
产物抑制的酶反应动力学：二、产物抑制的酶反应动力学与上述可逆反应不同，产物抑制系指当产物与酶形成复合物EP后，就停止继续进行反应的情况，特别是当产物浓度较高时有可能出现这种抑制。 其反应机理式为其中EP为无活性的端点复合物
应用稳态法推导出下列反应速率方程式，称为产物抑制解离常数。与无抑制相比较，最大反应速率值rmax不变，米氏常数增大了倍，同竞争性抑制一样，使反应速率下降。
多底物酶反应动力学：三、多底物酶反应动力学对于一般的酶催化反应可用下列通式表示：在这种情况下，动力学方程中包含A、B、C…及P、Q、R…的浓度项，因而非常复杂，动力学参数也很多。 属于这类多底物反应的酶有氧化酶、转移酶、连接酶等。 这里仅涉及双底物酶催化反应的动力学。
双底物反应的三种机制：对双底物酶催化反应的机理，一般认为要让两个底物同时与酶的活性部位相结合形成复合物似乎不太可能，而是双底物酶反应系统中复合物的形成有三种最简单的情况，即随机机制、顺序机制和乒乓机制。
随机机制：要点如下。
随机机制的速率方程：反应速率可表示为
S2恒定时的速率方程：当假定[S2]恒定时，经推导可得其中
S1恒定时的速率方程：当假定[S1]恒定时，同样可推导得其中解离常数：
顺序机制：要点如下。
乒乓机制：3．乒乓机制最主要的特点是底物S1和S2始终不同时与酶结合，其机理式
乒乓机制的速率方程：要点如下。
第五节酶的失活动力学酶是一种不稳定的物质，常因温度、pH等因素的影响而产生不可逆的活性下降。酶在保存和参与反应时均可能失活。前者的失活又称为稳定性。在使用时酶的失活规律对于酶催化反应过程的设计和控制都是十分重要的。其中酶的热失活，或称作热变性是最重要的一种酶失活形式。
未反应时的热失活动力学：一、未反应时的热失活动力学了解未反应时酶的热稳定性关系到酶的保存。 测定酶未反应时的热稳定的方法，是在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定的时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。
在不同温度下反复测定，即可得到一条曲线。该曲线可以表示的酶失活特性，称为酶的热稳定性。若改变保温时间，则会得到不同的稳定曲线。
如要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活性对其失活时间作图，则又可得到一条曲线，该曲线称为失活曲线。
热变性的两类失活：要点如下。
该模型又称为一级失活模型。以E和D分别表示活性酶与失活酶，则失活反应方程式可表示为Kd和Kr分别表示正、逆反应的速率常数。时间为t时，活性酶E的浓度为[Et]，则活性酶的浓度随时间的净减少速率为
不可逆失活的浓度方程：要点如下。
多数酶的热失活服从上式，kd可称为衰变常数，单位为。kd的倒数称为时间常数td。当[Et]为[E0]的一半的时间称为半衰期。用表示。kd、td和之间的关系为
二、反应时酶的热失活动力学反应时酶的稳定性将直接关系到酶的使用寿命，因而特别重要。酶在反应中的稳定性称为操作稳定性。假如做不同温度下反应转化率随时间的变化曲线，即反应过程曲线，可得到如图所示的结果。（a）以温度T为参数，转化率X与时间t的关系曲线（b）以时间t为参数，转化率X温度T的关系曲线
从图中可以看出，在时间一定时，随着温度的升高，反应速率在增大，因而转化率在提高；但当温度高到某一数值时，其转化率反而下降。这时因为当温度升高到某一值，酶的热失活速率也在加速，致使活性酶的量在减少，因而反应速率下降，最终为0。又从图中曲线可看出，对某一反应时间，就有一转化率最高的温度，该温度称为最佳温度。不同的反应时间，有不同的最佳温度。最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果。
底物浓度影响的失活模型：对于底物浓度的变化对酶稳定性的影响，提出了下述模型。
底物影响失活的速率方程：根据上述机理可看出，无论是游离酶还是酶的复合物均有可能失活，其失活速率方程可表示为式中其中为底物对酶稳定性的影响系数,[Ef]为游离酶浓度。
底物对酶失活的四种影响：要点如下。
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