10 第二章 酶促反应动力学.doc

第1页：酶促反应动力学教学基本内容

2 酶促反应动力学

教学基本内容

酶促反应的特点；米氏方程的推导；抑制剂对酶促反应的影响与竞争性、非竞争性抑制方程推导；产物抑制与底物抑制；多底物酶促反应动力学；固定化酶与内外扩散过程分析；酶的失活动力学。

授课重点

1. 酶的应用研究与经典酶学研究的联系与区别
2. 米氏方程
3. 竞争性抑制酶促反应动力学方程
4. 非竞争性抑制酶促反应动力学方程
5. 产物抑制酶促反应动力学方程
6. 底物抑制酶促反应动力学方程
7. 双底物酶促反应动力学方程
8. 外扩散对固定化酶促反应的影响与 Da 准数
9. 内扩散对固定化酶促反应的影响与 φ 准数
10. 酶的失活动力学

第2页：本章教学要求

本章主要教学要求

1. 掌握稳态法和快速平衡法推导酶促反应动力学方程
2. 了解酶的固定化方法，理解固定化对酶促反应速率的影响，掌握 Da 准数与 φ 准数概念
3. 了解酶的一步失活模型与多步失活模型，以及反应过程中底物对酶稳定性的影响

第3页：酶促反应动力学的特点与速率式

2酶促反应动力学1.酶促反应动力学的特点1.酶的基本概念2.酶的稳定性及应用特点酶是以活力、而不是以质量购销的。酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。3.酶的应用研究与经典酶学研究的联系与区别经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。2.均相酶促反应动力学均相酶促反应动力学是以研究酶促反应机制为目的发展起来的。作为酶工程技术人员，如果仅仅比较详细地解释了酶促反应机制和过程是不够的，还应对影响其反应速率的因素进行定量的分析，建立可信赖的反应速率方程，并以此为基础进行反应器的合理设计和确定反应过程的最佳条件。因此，以讨论反应机制为目的的酶促反应动力学与为了设计与操作反应器的工业酶动力学，在研究方法上自然不同。这与化学中的反应动力学和工业上的化学反应动力学的不同一样。1.酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。k对酶促反应ABPQ，有：rrArPkCACB（2－1）rAdCAdtdCP（2－2）dtrP（2－3）式中，k：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。

第4页：连锁反应与快速平衡法推导

对连锁的酶促反应，如Ak1Mk2P，有：AdtdCAkC（2－4）1A2MMkCkCdtdC（2－5）2MPkC（2－6）dtdC2.2.2单底物酶促反应动力学（米氏方程）单底物不可逆酶促反应是最简单的酶促反应。水解酶、异构酶及多数裂解酶的催化反应均属此类。对单底物酶促反应SP，根据酶－底物中间复合物假说，其反应机制可表示为：k2k1k1ESESEPk1下面我们分别采用快速平衡法和稳态法推导其动力学方程。快速平衡法：几点假设：1CS>>CE，中间复合物ES的形成不会降低CS。2不考虑EPEP这个可逆反应。k2（3）ESES为快速平衡，ESEP为整个反应的限速阶段，此k1ES分解成产物不足以破坏这个平衡。根据以上假设，建立动力学方程：rk2CES（2－7）1kk1CSCECSKES（2－8）CE0CECES（2－9）解之，得rk2CE0CSKSCS令rmaxk2CE0，（2－10）（2－11）

第5页：稳态法推导与米氏方程

则rKSCSrmaxCS（2－12）稳态法：几点假设：1CS>>CE，中间复合物ES的形成不会降低CS。2不考虑EPEP这个可逆反应。3CS>>CE中间复合物ES一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使dt中间复合物ES浓度保持衡定，即dCES0。根据稳态法假设建立动力学方程：rk2CES（2－13）1ES1ES2ESkCCkCkC0ESdtdC（2－14）CE0CECES解之，得（2－15）SCkk1k2k2CE0CSr1（2－16）令rkC，Kmax2E0m1kk1k2（2－17）则rKmCSrmaxCS（2－18）上式即为通常所说的米氏方程。米氏方程可用图形表示：rrmaxrmax/2KmCS图2－1酶浓度一定时反应速率与底物浓度的关系

第6页：米氏方程讨论与双倒数法

讨论

SmKrmax（1）当CS<<Km时，rC，属一级反应。（2）当CS>>Km时，rrmax，属零级反应。Sm2m（3）当C＝K时，rrmax。K在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。Km和rmax的测定方法LinewearBurk法，即双倒数法。rmaxrmaxCS对米氏方程两侧取倒数，得1r1KmrCS1。以1~1作图，得一直线，1直线斜率为Km，截距为。根据直线斜率和截距可计算出K和rmmax。－1／Km1／CS图2－2双倒数法求解Km和rmax2.2.3温度对酶促反应速率的影响温度对酶促反应速率的影响，是通过影响k2和KS（Km）实现的。2RTkAexp(Ea)Arrhenius方程（2－34）RTSKexp(H)Van’t-Hoff方程（2－35）值得注意的是Arrhenius方程仅在较低温度下适用于酶促反应。过高的温度将导致酶的失活（见教材P23图2-4）。（2－35）式中H为反应热。1／rmaxrmaxrmax1／r斜率－Km/rmax

第7页：失活与抑制的区别及竞争性抑制

图2－3竞争性抑制作用示意图反应机理：k2k1ESESEPk1（2－36）KIEIEI采用快速平衡法推导动力学方程：rk2CES（2－37）（2－38）SCkES1CECSk1K（2－39）IEICECIKC（2－40）CE0CECESCEI解之，得（2－41）KS(1CI/KI)CSrmaxCSr（2－42）E4.抑制剂对酶促反应速率的影响首先应搞清失活作用与抑制作用的异同。失活作用：指物理或化学因素部分或全部破坏了酶的三维结构，引起酶的变性，导致酶部分或全部丧失活性。抑制作用：指酶在不变性条件下，由于活性中心化学性质的改变而引起酶活性的降低或丧失。凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。1.竞争性抑制SI

第8页：竞争性抑制的稳态法推导

1k式中，rmaxk2CE0，KSk1采用稳态法推导动力学方程：rk2CES43）（2－1ES1ES2ESkCCkCkC0ESdCdt44）（2－iEIiEIkCCkC0EIdtdC（2－45）CE0CECESCEI（2－46）解之，得Km(1CI/KI)CSrmaxCSr（2－47）max2E0式中:rkC，K1kk1k2m令KmKm(1CI/KI)，（2－47）式可变形为mSKCrmaxCSr（2－48）式中KmKm将（2－48）式与米氏方程比较，可知最大反应速率测有变化，而Km增大。以rCS11K1rmaxrmax~作图，得一直线，直线斜率为m，截距为，如图2－3所示。1／r1／CS1／rmax-1／Km-1／Km’CI=0CI

第9页：非竞争性抑制的反应机理

图2－5非竞争性抑制作用示意图反应机理：k2k1（2KI（2KIESESEPk1－49）EIEI－50）ESIESI－51）采用快速平衡法推导动力学方程：rk2CES－52）（2（2SCkES1CECSk1K（2－53）IEICECIKC（2－54）IESICCESCIK（2图2－4竞争性抑制作用下1~1曲线rCS2.2.4.2非竞争性抑制SIE

第10页：非竞争性抑制的稳态法推导

－55）CE0CECESCEI（2－56）解之，得rmaxCS(1CI/KI)(KSCS)r（2－57）max2E0式中，rkC，K1kk1S采用稳态法推导动力学方程：rk2CES（2－58）0k1CECSk1CESk2CESkiCESIkiCESCIESdtdC（2－59）iEIiEIkCCkC0EIdtdC（2－60）kiCESCIkiCESI0ESIdtdC（2－61）CE0CECESCEICESI（2－62）解之，得rmaxCS(1CI/KI)(KmCS)r（2－63）max2E0式中，rkC，K1kk1k2mIIrmax1C/Kmax令r'，（2－63）式可变形为

第11页：产物抑制的反应机理

KmCSrrmax'CS（2－64）式中rmax'rmax将（2－64）式与米氏方程比较，可知最大反应速率减小，而Km不变。rCS1rmax'rmax'以1~1作图，得一直线，直线斜率为Km，截距为，如图2－6所示。-1／Km1／CS图2－6非竞争性抑制作用下1~1曲线rCS2.2.4.3产物抑制酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的合成，从而降低了酶促反应的速度。k2k1KP反应机理：ESESEPEP（2k1－65）采用快速平衡法推导动力学方程：rk2CES－66）（2SCkES1CECSk1K（2－67）PEPCECPKC（2－68）CE0CECESCEP（21／rCI=0CI1／rmax’1／rmax

第12页：产物抑制与底物抑制

－69）解之，得KS(1CP/KP)CSrmaxCSr（2－70）max2E0式中，rkC，K1kk1S采用稳态法推导动力学方程：rk2CES－71）（2ESk1CECSk1CESk2CES0dtdC（2－72）pEPpEPkCCkC0EPdtdC（2－73）CE0CECESCEP（2－74）解之，得Km(1CP/KP)CSrmaxCSr（2－75）max2E0式中，rkC，K1kk1k2m可见，产物抑制实际上属于竞争性抑制。2.2.4.4底物抑制对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，rp呈下降的趋势，这种反应被称为高浓度底物抑制或底物抑制（substrateinhibition）型反应。r

第13页：底物抑制与多底物动力学

图2-7底物抑制示意图反应机制：k2k1ESESEPk1KSSESSESS采用快速平衡法推导动力学方程：rk2CES（2－76）SCkES1CECSk1K（2SSESSC－77）CESCSK（2－78）CE0CECESCESS（2－79）解之，得rmaxCSKSCS(1CS/KSS)r（2－80）max2E0式中，rkC，K1kk1。S2.2.5多底物酶促反应动力学一般的多底物酶促反应可表示为：ABCPQR反应式中包含多种底物和多种产物，因此反应动力学方程较为复杂。这里仅讨论双底物酶促反应生成两种产物的情况。设计两底物酶促反应动力学模型时会提出这样一个问题，即哪一个底物先与酶结合。两底物同时与酶结合的可能性可以排除，因为这要求三体碰撞。很清楚，除非有证据表明，确实是A先与酶结合或B先与酶结合，否则，只能假定两底CS0

第14页：双底物反应的随机机制

图2-8双底物双产物酶促反应随机机制两底物A、B都有可能先与酶结合，既可能是酶先与B结合形成EB，再与A结合，生成EAB，也可能是酶先与A结合生成EA，再与B结合生成EAB。EAB为三元复合物。EAB转变为EPQ，EPQ再释放出产物。产物的释放也是随机的，既可能先释放出Q，生成EP，再释放出P，生成E；也可能先释放出P，生成EQ，EQ再释放出Q，生成E。在随机机制中出现了三元复合物EAB，而有些反应模型中并不形成三元复合物。如下图所示：（2-81）EA释放出产物P后，基团G仍保留在酶分子上，在酶分子上的G再与B结合生成Q。在该模型中，没有出现三元复合物，但出现了一种“修饰过的酶”EG。在某些酶促反应中，反应机制可能要简单得多。如：（2-82）3.固定化酶促反应动力学1.固定化酶促反应动力学基础这里分三个方面讨论：什么是酶的固定化？为什么进行酶的固定化？怎样进行酶的固定化？生物工业用酶大多为水溶性，酶促反应体系为均相体系，均相体系简单，但EAEQ物中的任何一个都有可能与酶结合。这样可提出随机机制（或分支机制），随机与分支在这里有相同的含义，只是从不同的角度描述同一个问题。随机是从概率的角度，分支是从反应的途径上描述。EPEBEABEPQEEEEAEG＋A－A－P＋P＋B－B＋QEQ－QEEEAEAB＋A－A＋B－BEPQ－Q＋QEPE－P＋P

第15页：酶的固定化技术与方法

存在一个缺点，就是酶难以回收利用，同时，酶和产物混在一起，给产物的提取带来困难。解决此问题可采用酶的固定化技术。1.酶的固定化技术定义酶的固定化技术就是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料，制成固相酶的技术。细胞的固定化技术：为省去从微生物（动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞，动植物细胞、组织技术。2.酶和细胞固定化方法作用力载体物理吸附石英砂，多孔玻璃，淀粉，硅胶，物理吸附法活性碳载体结合法离子结合法离子键共价结合法共价键离子交换树脂纤维素，尼龙包埋法：将酶包埋在凝胶的微细格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过。格子型常用凝胶：角叉菜胶，明胶，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶微胶囊2.3.1.3固定化对酶性质的影响1底物专一性的改变由于立体障碍，使的底物特异性发生改变。例如，胰蛋白酶既作用于高分子的蛋白质，又作用于低分子的肽或多肽。采用羧甲基纤维素对胰蛋白酶进行固定化后，胰蛋白酶对二肽或多肽的作用不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的3％左右。2稳定性增强一般固定化酶比游离酶稳定性好，表现在热稳定性，保存和使用稳定性的增交联法：利用双功能试剂，在酶分子间发生交联，凝胶形成网状结构。OEOEEOOE

第16页：固定化对酶性质的影响与五大效应

加，及对蛋白酶的抵抗性和耐受性增强。3最适pH值和最适温度变化酶固定化载体为多聚阳离子性质时，固定化酶的最适pH值向酸性一侧移动；酶固定化载体为多聚阴离子性质时，固定化酶的最适pH值向碱性一侧移动；产物为酸性时，固定化酶最适pH值向酶性一侧移动；产物为中性时，最适pH值一般无变化。4动力学参数的变化酶经固定化后，表观米氏常数发生变化。2.3.1.4影响固定化酶促反应的主要因素1分子构象的改变指固定化过程中酶与载体的相互作用引起酶的活性中心或调节中心的构象发生了变化，导致酶与底物的结合力下降。（见教材P27图2－6）2位阻效应由于载体的遮蔽作用或固定化方法不当，给酶的活性中心或调节中心造成空间障碍，使底物和酶无法与酶接触。（见教材P27图2－6）3微扰效应由于载体的亲水性、疏水性、介电常数等性质，使酶所处的微环境与宏观环境不同，从而改变了酶的催化能力或酶对效应物的调节能力的效应。4分配效应由于载体与底物之间疏水性、亲水性或静电作用引起微环境和宏观环境之间物质的不等分配，从而影响酶促反应速率的一种效应分配效应可用分配系数KP来定量描述。Kp的定义：载体内外底物（或其他物质）浓度之比。Kp的测定：在已知底物浓度CS0、体积V0的溶液中，放入不含底物的一定体积V’的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度CS。(5)扩散效应由于底物、产物或其他效应物的迁移和传递速度所受到的限制，当物质扩散系数很低，酶活性较高时，在固定化周围形成浓度梯度，造成微观环境和宏观环境间底物、产物浓度产生差别。扩散效应可定量描述。2.固定化酶促反应中的过程分析1.外部扩散过程当固定化酶促反应受外部扩散限制时，固定化酶表面处底物浓度CSS小于主体溶液底物浓度CS，因此固定化酶促反应速率rout小于未固定化时的酶促反应速

第17页：固定化酶的外部扩散过程

率ro。用外扩散效率因子out表示外扩散对固定化酶促反应的影响。记作rmaxCSSoutroKmCSSroutKmCSSCSSrmaxCSKmCS－83）（CSKm时，routro）可见，只要确定了固定化酶表面浓度CSS，即可计算外扩散效率因子out。那么，固定化酶表面底物浓度CSS又如何确定呢？以表面固定化酶为例。主体溶液底物浓度为CS，载体外表面底物浓度为CSS。（2N=kLa(CS-CSS)，Nmax=kLaCS反应外扩散速率（2-84）酶促（2-85）速率KmCSSrmaxCSSoutrout达到平衡时，Nr，即LSSSka(CC)mSSrmaxCSSKC（2-86）由（2－86）式即可唯一确定CSS。CSS也可用图解法确定。r~CS曲线与N~CS曲线交点即为(CSS，rout)。CSSCSN，rNmaxrmax0CSSCSN，rrmaxNmax0CSSCSSSout(C，r)(CSS，rout)

第18页：Da 准数与外扩散效率因子

图2-9图2-10图2-9为rmaxNmax的情况，此时CSS0,out0；图2-10为rmaxNmax的情况，此时CSSCS,out1。Darmax，称为Da准数Nmax当Da1时，CSS0,out0，过程为外扩散控制。当Da1时，CSSCS,out1，过程为反应控制。令C*CSS,KKm，（2-86）式可变形为：CSCSmaxC*rLS(1C*)maxkaC(1C*)NKC*整理，得C*NkaCrrmaxLS(1C*)(KC*)Damaxmax（2－87）上式表明C*为Da准数的函数，即C*f(Da)。令C*CSS,KKm，（2－83）式可变形为CSCSKC*C*out－88）（2（2－88）式表明out为C*的函数，即outg(C*)。由此可知，Da准数是决定效率因子out和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，out越接近1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，out越小，越趋近于零。

第19页：减小 Da 的措施与内扩散过程

可见，为提高固定化酶外扩散效率，应设法减小Da准数。从公式DakLaCSrmax可知，减小Da准数的方法有两个，一是降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积a，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径；二是使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大kL。2.3.2.2内部扩散过程具有大量内孔的球形固定化颗粒，其内部是酶促反应的主要场所，底物通过孔口向内扩散，达到不同深度，产物沿反方向从内部向孔口扩散。颗粒内部各点处底物和产物浓度不同，导致各处的反应速率的差异。内扩散效率因子in的定义为单位时间内颗粒内部实际酶促反应速率rin与按颗粒外表面底物浓度计算而得到的反应速率ro之比。记作rinroin图2－多孔球形固定化酶颗粒内的物料衡算对球形固定化颗粒，半径为R，在距中心处为r处取一厚度为dr的微元壳体，在微元壳体内，底物浓度CSr，稳定状态下，对底物S进行物料衡算：流入量－流出量＝反应量drdr4(rS2224rrdrrdr)DedCSrdCSr4rDerdr(2-90)整理，得drdr2224rrSdrrdCSrdCSr2rdr(dr)]De4[r24rDerdr(2-89)为获得固定化酶颗粒内部实际反应速率rin，就要首先确定颗粒内部底物浓度分布。drR

第20页：内扩散的物料衡算与西勒准数

drdrdrSSr4r2rdrSr2dCSr8rdrDerdC4rDerdrdCrdr两侧同除4r2Dedr，得d2CSr2dCSrrSrdrDedr2(2-91)rmaxCSrKmCSrS当酶促反应符合米氏方程规律时，在微元壳体内r故，dr2d2CSrmSrrmaxCSr2dCSrrdrDe(KC)(2-92)CSSC令CXSr，lrCR2rRKm9DeKm，SS，2max式中为西勒（Thiele）准数，其物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的的定义式为122CS,eqPDersdCsVPrsCSSA将(2-92)式转化为无因次形式，得X1cXX92Xdl2ldld2c2dcc(2-93)dt边界条件：l0，dcX0l1，cX1该微分方程无解析解，只能用数值法求解。KmCSSKmCSSindrRDedCSrdCSrrRrmaxCSS3rmaxCSS2rindtrR33ro4R4RDe(2-94)引入无因次参数，则

第21页：内外扩散过程的比较

表 2-1 外扩散过程与内扩散过程的比较

第22页：一步失活与多步失活模型

dEEkCdtdC（2－96）边界条件：to,CECE0积分，得CECE0exp(kdt)－97）几个概念：kd：一步失活常数。（22t1/2：半衰期，当tt1/2,CE1CE01kdtc：时间常数，tc三者关系：kd1kdt1/2ln2，tc（2－98）2.4.1.2多步失活模型(multistepmodel)多步串联失活模型：酶的失活经历多步，即EFD可划分为同步失活模型：全部酶分子可划分为热稳定性不同的若干个组分，每个组分均符合一步失活模型。对同步失活模型，全部酶中残存活性酶的比率iiiCE0(t)CExexp(kt)（2－99）式中，xi为失活速率常数为ki的酶组分的分率。因此，xi1i多步串联失活模型较为复杂，这里不再详细讨论。复习题14题即为多步失活模型的一个实例。2.4.1.3温度对酶失活的影响温度对酶失活的影响体现在改变酶失活速率常数上。对一级失活模型，有

第23页：温度对酶失活的影响

EkAdddexp失活反应RTArrhenius方程（2－100）式中，Ad—失活反应Arrhenius方程的指前因子Ed—失活反应活化能一般蛋白质的变性或失活的活化能在125kJ/mol以上，高于一般化学反应的活化能（20～83kJ/mol），这意味着酶失活对温度十分敏感。同时考虑温度和时间对酶失活影响的关系式RTECddA(t,T)CEexpAtexpE0（2－101）教材中P35图2－11是根据上式绘出的图形。可以看出时间和温度对酶失活的双重影响。在同一温度下保温时间越长，残存酶活力越低。2.反应中酶的热失活动力学酶的稳定性与酶的寿命直接相关，因此至关重要。酶在反应中的稳定性称为操作稳定性。酶的操作稳定性测定方法：分批测定法、连续测定法、圆二色性分析法。不同温度下酶促反应过程曲线见教材36页图2－12。一定的酶促反应都是由正向的酶促反应与酶的失活反应的复合。当时间一定，随温度的升高，反应速率增大，转化率提高，但当温度高于某一值时，由于酶的热失活速率加快，当快于酶促反应速率上升的速度时，酶的总反应速率下降，最终降为零。对某一反应时间，就有一与最高转化率对应的温度，该温度称为最佳温度。不同的反应时间，有不同的最佳温度。最佳温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。1.反应中酶的失活模型k1k2ESESEPk1－103）（2kdED－104）（2kdESDS

第24页：反应中酶的失活模型与 δ 讨论

（2－105）按此模型推导其失活动力学方程：dEdESESkCkCdtdCE0d(CECES)dCEdCdtdtdt（2－107）1ES1ES2ESkCCkCkC0ESdCdt－108）（2CE0CE0CES－109）方程联立求解，得（2KmCSKmCSdKmCSCE0KmdCE0kkCdE0kCE0CSdKmCSdt－110）（2（式中，Kk1k1k2）m讨论：（1）＝1时，KmCS＝1，反应时与未反应时酶的失活速率完全相同。KmCS从反应机制中可以看出，＝1时，复合物ES与游离酶E失活速率常数完全相同，表明底物对酶失活无影响。（2）＝0时，KmCS取最小值，反应时酶失活速率达到最低。从反应机KmCS制中可以看出，＝0时，复合物ES完全不失活，或者说酶完全被底物所保护。（3）0<<1时，KmCS1，反应时酶失活速率低于未反应时酶失活速率。KmCS从反应机制可以看出，0<<1时，复合物ES失活速率常数低于游离酶E，或者说底物对酶失活有部分保护作用，能在一定程度上抑制酶的失活。（4）>1时，KmCS1，反应时酶失活速率高于未反应时酶失活速率。KmCS从反应机制中可以看出，>1时，复合物ES失活速率常数大于游离酶E失活速率常数，或者说底物加速酶的失活。

第25页：习题：作图法求动力学参数

由上述分析可见，反映了底物对酶失活速率的影响，因此称为底物对酶稳定性影响系数。习题与答案3．应用直线作图法（Lineweaver-Burk法；Haneswoolf法；Eadie-Hofstree法和积分法）求米氏方程中的动力学参数KS和rmax，并比较各种方法所得结果误差大小。rrmaxrmaxCS答：(1)Lineweaver-Burk法：米氏方程可变形为1rCS1Km11，以1~作图，将得一直线，直线截距为1，斜率为Km，据此计算rmax和Km。此法由rmaxrmax于采用两个独立变量1和1，底物浓度很低时，反应速率也很低，取倒数，误rCS差较大。rmaxrmaxCSr(2)HanesWoolf法：米氏方程可变形为CSKmS，以CS~C作图，rrmax将得一直线，直线截距为Km，斜率为rmax1，据此计算rmax和Km。此法在底物浓度很低时误差较小。maxCSCSr(3)EadieHofstee法：米氏方程可变形为rrKmr，以r~作图，将max得一直线，直线截距为r，斜率为mCSKmaxm，据此计算r和K。上述方法的共同点，是要从动力学实验中获取不同的CS值和r值。而r不能由试验直接取得，试验中能直接得到的是不同时间t时的浓度CS值（或CP值）。为此需要根据速率的定义式rdtSdCS，在C～t的关系曲线上求取相应各点切线的斜率，才能确定不同时间的反应速率r。这种求取动力学参数的方法又称之为微分法。显然，用这种微分法作图求取反应速率会带来较大的误差。(4)积分法。米氏方程积分后可变形为

第26页：习题：酶催化水解反应机制

CSCSln0t1KmCS0CSKmrmaxCS以~CS0CSCSln0tCS0CSCS0CSKmKm1作图，将得一直线，直线斜率为rmax，截距为。因此直接采用动力学实验中测得的时间t、底物浓度CS数据作图，即可求取动力学参数值。6.许多酶催化水解反应的机制式为：k1k2k2ESESES'P1，ES'H2OEP2k1整个反应分两个阶段进行，采用稳态法建立反应动力学方程，均可写成如下形式：rkcalCE0CSKmCS解：酶催化水解反应机制为k1k2ESESES'P1k1k2ES'H2OEP2采用稳态法推导反应动力学方程：1ES1ESSSkCCkCdtdCrr1ES1ES2ESkCCkCkC0ESdtdCk2CESk3CES'CH2O0ES'dtdCCE0CECESCES'解之，得Sk1(k2k3CHO)k2k3CH20SCCCkCCkCCKmCSE0Sk2k3CH0k3CHOk1k1k2(k1k2)k3CH20r2E0S2calE0S22k2k3CH02C

第27页：习题：温度对稳定性与活力的影响

k2k3CHOk2k3CH2Ocal式中，k22k1(k2k3CHO)(kk)kC123H2Om，K7．有人研究了不同温度对酶的稳定性与酶活力的影响，得到如图2-13所示结果。基于此，他得到结论是：该酶在50C以下是稳定的，并且最适反应温度为35C。这一结论正确与否，请说明。答：（1）酶的稳定性受温度和时间的双重影响，其函数表达式为RTECddA(t,T)CEexpAtexpE0表明温度和时间对酶稳定性的双重影响。在同一温度下，不同的保温时间残存酶活力有极大差异。图（a）中不同温度下保温10min后残余酶活力曲线只表明，在保温时间为10min时，酶在50C以下是稳定的，而并不能得出“酶在50C以下是稳定的”这一结论。因为不同的保温时间必将对酶的稳定性产生影响。（2）一定的酶促反应都是由正向的酶促反应与酶的失活反应的复合。当时间一定，随温度的升高，反应速率增大，转化率提高，但当温度高于某一值时，由于酶的热失活速率加快，当快于酶促反应速率上升的速度时，酶的总反应速率下降，最终降为零。对某一反应时间，就有一与最高转化率对应的温度，该温度称为最适温度。不同的反应时间，有不同的最适温度。最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果。图（b）只表明反应时间为10min时，酶的最适反应温度为35C。但并不能笼统地说酶的最适反应温度为35C。因为如果反应时间变化，酶的最适反应温度将发生变化。8.一般对于同一种酶促反应，在进行连续反应时的实际操作温度比分批实验所求得的最适温度要低。请从实际反应时间较长来说明，并说明原因。答：最适温度是温度对酶促反应速率和酶失活速率双重作用的结果，酶的失活又受温度和时间的双重影响。因此不同的反应时间，有不同的最适温度。当反应时间较长时，在较低的温度下即可达到短时反应较高温下所能达到的同样的失活速率，从而引起酶最适温度的降低。通常连续式操作比分批式操作时间长，因此，其最适反应温度比分批实验的要低。9.利用稳态法建立可逆酶促反应的动力学方程。解：可逆酶促反应机制为k1k2ESESEPk1k2采用稳态法推导动力学方程

第28页：习题：可逆酶促反应动力学

2ES2EPPkCkCCdtdCr（1）1ES1ES2EP2ESkCCkCkCCkC0ESdtdC（2）CE0CECES（3）解之，得rk1k2CSCE0k1k2CPCE0k1CSk2CPk1k2（4）S2E0令rkC，K1kk1k2SsP，rk2k1rSPkk12，KK（5）则，1CS/KSCP/KPr(rS/KS)CS(rP/KP)CP（6）设平衡状态时底物浓度为CS,eq，产物浓度为CP,eq，平衡常数为Keq。有eqCS,eqCP,eqK（7）1CS,eq/KSCP,eq/KP(rS/KS)CS,eq(rP/KP)CP,eq达到平衡时，r0，即r＝0（8）化简，得，rPKSCP,eqrsKPCS,eq（9）故，（10）因反应为单分子反应，故CSCPCS,eqCP,eq(1Keq)CS,eqrPKSrSKPeqK

第29页：习题：固定化酶效率因子计算

（11）令CSCSCS,eq（12）将（10）、（11）、（12）式代入（6）式，得式中：SeqPSKPeqrKKKK1r'maxmaSxmKPKS(KeqKSKP)CS,eqKSKPK'10．某种酶以游离酶形式进行酶促反应时所得动力学参数Km=0.06mol/L和rm=10mol/(L.min)。该酶在某种载体颗粒表面固定化后进行同一酶促反应，所得动力学参数Km´=0.10mol/L和rm´=8mol/(L.min)。求底物浓度为1mol/L时，该固定化酶的效率因子η解：酶在载体表面固定化，因此固定化酶的效率因子为外扩散效率因子out。rmax'CS61101rmaxCSroroutKm'CS0.1010.57KmCS0.05112．实验测得分配系数KP分别为（a）KP1, (b)KP1, (c)KP1，试从概念上说明载体颗粒与反应液之间的固液界面处底物浓度的变化情况。答：分配系数KP的定义是载体内外底物浓度之比。（1）KP1，表明载体颗粒内底物浓度高于反应液中底物浓度，因此在载体颗粒与反应液之间的固液界面处，底物浓度由反应液中的浓度逐渐增大至载体颗outr'C'Km'CS'1S,eqSSS,eqSSrC'KPKeqeqSPS,eqSPCS'KPKSKPKSKKKCKKSPSeqC'K1rSSKSKPrSKKKeqKSKeq1KSKPKPKSKeqCS,eqKPKSCS'KK1KSKPKPCS'CS,eqKS(CS,eqKeqCS')eqrC'C1CKeqC'

第30页：习题：分配系数与界面浓度

粒内部浓度。2KP1，表明载体颗粒内底物浓度等于反应液中底物浓度，因此在载体颗粒与反应液之间的固液界面处，底物浓度等于反应液中底物浓度。3KP1，表明载体颗粒内底物浓度低于反应液中底物浓度，因此在载体颗粒与反应液之间的固液界面处，底物浓度由反应液中的浓度逐渐降低至载体颗粒内部浓度。13．书中在讨论内扩散对固定化酶促反应时，是以酶促反应符合米氏方程规律为基准的，试讨论如果酶促反应以一级或零级反应规律进行时，底物的稳态浓度分布与Φ的计算方法。解：（1）对球形固定化酶颗粒内微元壳体进行物料衡算，得drdr2224rrSdrrdCSrdCSr4rDerdr4(rdr)De（1）整理，得rdrDed2CSr2dCSrrSdr2（2）当反应符合一级反应规律时，微元壳体内，rSk1Csr（3）将（3）式代入（2）式中，得CSrrdrDed2CSr2dCSrk1dr2（4）SrCRCSx1Rk13De令lr,C,将方程（4）变为无因次形式ldld2Cx2dCx92Cxdl2（5）dl边界条件：l1,C1;l0,dCx0x解微分方程，得

第31页：习题：一级反应下的内扩散

lsinh(31)sinh(31l)CX（6）或Rsinh(31r)rlsinh(31)CSrCSR（7）2exex式中sinh(x)为双曲正弦函数，其定义式为sinh(x)oinRkCdrrR3DedtrRrrSdCSrdCSr132143Rk1CS4RDe（8）将（7）式代入（8）式，得111111)3tanh(31（9）式中tanh(x)为双曲正切函数，其定义式为exextanh(x)exex（2）当反应符合(10)将（10）式代入（2）式中，得零级反应时，rkordrDed2CSr2dCSrkodr2（11）oxDeCSkoRRCS32令lr,CCSr,，将（11）式变为无因次形式ldl2dCx182d2Cxdl2（12）dl边界条件：l1,C1;l0,dCx0x

第32页：习题：零级反应下的内扩散

32343112cos43rRoodr3dCSrDeRkRkodrrRdCSr4RDeorrin1221o3式中cosk1k214.如果酶的失活过程为二步串联方式，即EE1E212式中：k1和k2分别为失活常数；1和2分别为E1和E2在总酶活中所占百分比。试求时间t时酶活的残存活性比率(t)为多少？解：酶的失活符合二步串联模型k1k2EE1E2稳态法推导动力学方程：1EEkCdtdC1E2E1E1kCkCdtdC2E1E2kCdtdCCE0CECE1CE2解之,得CECE0ek1tCE1k1CE0ek1tek2t2112k2k1CE0E2ktkt1ek1ekk2k1C

第33页：习题：二步串联失活模型

(t)CE1CE12CE21k121t2k2tk1t2121212112CE0ktk1ek1ekk2k1ek1tek2tk2k1ek1t1k12kkkkekkkke2k11k12k21k1k3k416酶促反应机制式为ESES'ES''EP，证明采用稳态法获得反应速度k2SKC为rrmaxCSE0max，式中，rkk34134k(kk)Sk3k4，Kk4(k2k3)。CEOC为底物浓度，C为酶总浓度；CE为酶浓度；P为产物浓度；k1、k2、k3、k4分别为反应速度常数。解:根据酶促反应机制k1k3k4ESES'ES''EPk2采用稳态法建立动力学方程rk4CES''0k1CECSk2CES'k3CES'ES'dtdC3ES'4ES''kCkC0ES''dtdCCE0CECES'CES''解之,得34Sk3k4CE0CSk)Ck4(k2k3)(kkr1Sk(kk)CCkkk4(k2k3)CE0Sk3k434134rmaxCSKCS

第34页：习题：稳态法证明与转化率计算

E0k3k4max式中，rCk3k4，Kk4(k2k3)k1(k3k4)17．某酶促反应，其米氏常数Km为1mmol/L，底物初始浓度为3mmol/L。2min后，5%的底物被转化，试求10min、30min、60min后，底物转化率分别为多少？解：反应符合米氏方程，dtKmCSrdCSrmaxCS（1）边界条件：t0,CSCSo;tt,CSCSt积分，得lnCSt(CSoCSt)KmrmaxtCSo（2）令CSoCSt，则CSoCSoKmln(1)rmaxt（3）将t2min,5%及Km1mmol/L,CSo3mmol/L代入（3）式，可得20.10[mmol/(Lh)]135%ln(15%)trmax1CSoKmln(1)将Km1mmol/L,CSo3mmol/L,rmax0.10mmol/L代入（3）式，得3ln(1)0.10t当t10min,24.3%。当t30min,65.0%当t60min,95.7%

第35页：