16 第八章 生物反应工程领域的拓展.doc

第1页：领域拓展教学基本内容

8 生物反应工程领域的拓展

教学基本内容

质粒复制与表达的动力学；超临界相态下的生物反应；菌体形态在发酵液中的变化；界面微生物生长模型。

授课重点

1. 质粒复制动力学以及基因表达动力学
2. 菌体形态对传质的影响
3. 界面微生物生长动力学模型

第2页：领域拓展背景与 λdv 质粒

8生物反应工程领域的拓展1980年前后，生物工业的核心是微生物发酵工业，此时的生物化学工程领域更多地开展微生物培养工学方面的研究。由于1972年重组DNA技术的出现，1985年PCR技术的开发成功，极大地拓宽了生物反应工程所涉及的的领域。与此同时。人们对极端条件下微生物活性的变化以及微生物形态变化等方面，给予了更多的关注。拓宽了生物反应工程领域。1.质粒复制与表达的动力学利用DNA重组技术提高微生物生产有用物质能力已取得可喜的成果。为进行工程菌株发酵过程中的优化控制，有必要研究目的产物的产率与质粒的基因结构、基因数量，宿主的遗传特性及发酵过程中操作条件等之间定性与定量的关系。当基因的表达仅取决于微生物细胞所含基因数量时，工程菌细胞中所含质粒的稳定性及其复制与表达能力成为至关重要的因素。由于质粒的复制数对于提高工程菌株的生产能力是重要的决定因素，因此，下面简要介绍质粒复制与表达的动力学模型。1.λdv质粒的概述λdv质粒是从λ噬菌体中分离得到的小突变体，分子量为4.7×166，约为λ噬菌体的十分之一。λdv质粒的“核心区域”由自身控制区域和启始复制区域两部分构成。前者包括启动子基因、操作子基因、自身阻遇物基因和终止物基因；后者含有复制起源基因和初始物基因两部分。质粒复制子的基因结构（Matsebara,Mukai1975）λdv基因群是在PROR的支配下进行表达，I与Pr的复合体IPr和活性ori的相互结合控制着基因组的复制，而cro阻遏蛋白积聚起来会抑制自身操纵子的转录，最终是作为自身阻遏物而起作用。8.1.2动力学模型的几点假设1、λdv质粒是由PRORP基因构成的一单体形式；2、由于I蛋白质不稳定，其作为限制性初始物而起作用；

第3页：模型假设与质粒复制动力学

3、λdv质粒是以随机模型的方式进行复制，这已由DNA密度沉降实验所证实；4、复制起源点由于转录作用而活化，初始蛋白与活性化ori相结合形成一复合体，为起始复制，复合体的活性要达到某一临界值；5、细胞分裂时，质粒以均等方式进行分配；6、宿主细胞的体积以指数形式增长，质粒对宿主细胞的生长无影响。8.1.3质粒复制动力学λdv质粒复制动力学方程式见表8-1。动力学模型是以单细胞为基准，并假定mRNA与蛋白质的失活服从一级反应规律。1. R的合成（8-1）（8-2）2. I的合成（8-3）（8-4）3.ori的活性化（8-5）4.复制体的形成（8-6）

第4页：转录效率与生物合成方程

式中η称为转录效率。PROR处的转录效率是由RNA聚合酶与自身阻遏蛋白R相互作用竞争性与PROR结合所决定。由于启动子基因和操作子基因重合在一起，因此，R与OR1和0R2两者或之一相结合都会抑制启动基因。由统计热力学理论，可求得转录效率η为（8-7）式中，；为R的总浓度；Kl、K2和K3分别为R与OR1、0R2和0R3的结合常数，表示R与OR1、0R2和0R3的亲和力。（8-1）和（8-2）式为R的合成动力学方程，两方程右边第一项分别为mRNA与R的生物合成量；第二项分别为mRNA与R的失活量，第三项为由于宿主的生长而导致mRNA与R的变化量。mRNA与蛋白质在细胞内的浓度以单位体积细胞的摩尔数来表达，并随细胞的增殖而下降，两者的活力随失活作用而下降。在某一时刻t，质粒DNA浓度［G］为（8-8）式中G为每一个细胞内的质粒分子数；V为时间t时的细胞体积；NA为阿伏伽德罗常数（）。呈指数形式增殖的单一细胞每一世代中的体积变化可由下式来表示。时,（8-9）式中V0为新生细胞的体积；τ为宿主的增倍时间。在tR1处的转录终止效率f取值范围为0至1。o基因的转录速率与η、（1-f）和呈比例关系，I蛋白的生物合成方程式如（8-3）和（8-4）式。根据上述，通过启始复制领域的转录，使ori部位活性化，即由于o基因的转录频率决定了复制起始领域的活性化，形成具有活性的。

第5页：ori 活性化与复制体形成

（8-10）具有活性的与非活性的关系为（8-11）式中为ori的总浓度。将（8-11）式代入（8-10）式，可得（8-5）式，在（8-5）式中（8-12）由于λdv质粒是以随机选择模型进行复制,一定时间间隔内,仅有一个质粒进行复制。因此,由（8-8）式，可表示为（8-13）根据前述，活性复制复合体REP的量取决于λdv质粒起始复制的频率。REP形成的模式如下所示。（8-14）（8-15）式中：KA为I与Pr结合的平衡常数；*KB为ori与I

• Pr结合的平衡常数。由I、Pr和ori*的物量衡算（8-16）（8-17）

第6页：质粒的复制完成与分配

（8-18）并假定与，由（8-14）～（8-18）式可得（8-6）式中K0为一常数，当［REP］达到一临界值时，质粒DNA开始复制。如果λdv质粒DNA以大肠杆菌染色体复制叉内新链的生物合成速率来复制的话，整个λdv分子约在0.05min内完毕复制。因此，假定λdv质粒的复制与菌体生长周期时间无关，一旦开始复制，可在瞬间完成是合理的。若某一新生宿主细胞内质粒的分子数为G(0)，到时间t时，宿主细胞内的质粒数为（8-19）式中m是一整数，表明从时间为O至t时新增加的质粒分子数。另外，由均等分配模型，在n十l世代时每个子细胞的质粒数为（8-20）式中INT()表示取整数的意思，n是世代数，为倍增时间。式（8-20）给出解上述微分方程组的一边界条件。另一初始条件为G1(0)=1。8.1.4基因表达动力学克隆基因的表达动力学方程是（8-21）（8-22）

第7页：基因表达动力学

式中P表示目的产物,为产物的失活常数。为评价增殖速率对克隆基因表达的影响，就有必要讨论宿主的增殖速率与上述方程中某些参数间的定量关系。当然，这种定量关系还受到宿主细胞活力与环境条件所影响。总转录速率常数与翻译速率常数可由以下两式所决定。（8-23）（8-24）式中，与为换算因子；Kme与Kpe分别为单位活性RNA聚合酶的mRNA链与单位活性核糖体多肽的“延伸”速率；Np与Nr分别为单位DHA模板上活性RNA聚合酶和单位mRMA转录子上活性核糖体的分子数。利用转录子的尺寸去除转录中RNA聚合酶分子之间平均距离dp与翻译中核糖体之间的平均距离dr可得到Np与Nr。dp和dr与μ之间的关系式（8-17）和（8-18）。（8-25）（8-26）根据上述，当取τ=l时（8-27）（8-28）由于细胞内各种成分的浓度取决于细胞的体积、细胞的增殖速率等，因此，每一新生菌体细胞的体积V0为（8-29）式中，Vi是宿主细胞的体积，一般取值为0.35～0.78μm；C为染色体的复制时间，D为染色体复制终止至细胞分裂完成为止这一段间，一般取值为42～78min。

第8页：超临界相态下的生物反应

以上是以细胞内质粒的复制与表达能力为讨论对象，其模拟结果能否与实际反应器内的表征数据相一致，还有待于研究。这是由于，从反应器内测得的某一种物质的浓度，除受到细胞内外各种物质的影响外，更主要的还受到细胞膜、细胞壁与反应液中传质的影响。特别是如何从系统生物学的角度探讨生物反应将是非常有意义的工作。2.超临界相态下的生物反应1.超临界二氧化碳的特点超临界流体（SCF）是指那些在临界温度和临界压力以上以流体存在的物质。其超临界点是气液共存曲线的交点。CO2流体的超临界温度在31.1℃，超临界压力在7.38MPa以下，属于较低温度和压力的超临界流体。超临界二氧化碳（SC-CO2）以其无毒，不燃，价格低廉等优点被人们广泛应用于超临界化学反应、超临界萃取、超临界反应等领域。SC-CO2还具有优良的溶解度特性。常规条件下一些难溶解的物质，在超临界相态下具有较大的溶解度。2.SC-CO2中酶的催化反应高压下，二氧化碳分子会大量溶解于酶周围的水膜中，使局部pH值降低，因此一些酶的活力会有部分的下降。此外，二氧化碳分子还能与蛋白质表面的氨基发生反应，改变酶的活性。3.微生物在SC-CO2中的活性变化SC-CO2对微生物菌体的影响有：1、CO2作为细胞的一种“麻醉剂”进入细胞膜，导致细胞膜磷脂双分子层中的疏水端区域结构改变、临界宽度变宽。2、CO2通过膜的渗透作用进入细胞质，导致细胞质的pH值变化，同时CO2与细胞质内的酶蛋白结合也会使酶的催化活性降低。3、高浓度CO2改变菌体内酶的催化反应速率，导致某种代谢终产物或代谢中间产物的大量积累。8.3丝状真菌发酵过程中菌体形态变化对于微生物发酵与菌体形态变化之关系，随着计算机技术的发展，给人们提供了新的认识空间。特别是菌体形态与相关影响因素、操作方式的相互关系，形态动力学研究以及与形态相关基因方面的工作，丰富了相关发酵过程理论。8．3．1菌体形态的量化描述采用计算机图象识别方法研究微生物形态，需对菌体形态进行量化描述。由固定在显微镜上的CCD摄象机采集到的一幅微生物形态图象，虽然可以采用手工测量的方法从照片上获得一定信息，但非常费时，而且不够准确。为从这幅图像中获得尽可能多的信息，就有必要确定一定形态参数来描述菌体形态特征。进

第9页：菌体形态的量化描述

行菌体形态的定量描述时，首先将经显微镜放大的菌体形态通过CCD摄象机和图像采集卡，将菌体形态图像转化为512×512×8bit格式（或其它）的数字化图像。然后通过二值细化方法等对图像进行测量、分析和比较。一般，将丝状菌的菌体形态分为分散状、交织状和菌丝团三大类。虽然已有较多的报道，但是菌体形态的量化描述还存在一些问题。例如已有的报道，都有具体的事例，但还没有一个令人满意的共性的描述方法；由于菌体形态的多种性，加上影响因素的多样性，还不能简单地认为一种菌体形态与一种影响因素线性对应。8.3.2操作参数与菌体形态的关系Cui等人认为，深层发酵中分子扩散是菌丝团内部氧传输的主要方式，菌丝团内部的对流和湍流作用均可忽略。单位湿菌丝团体积的菌体量随着DO强度的增加而增加，随着菌丝团尺寸的增加而减小。因此，菌丝团的疏松度是DO强度和菌团大小的函数。丝状真菌是多细胞结构，形态各异，其生长是以其顶端延长的方式进行。发酵过程中，沿着菌体的长度会发生生理变化和细胞的分化。菌体总量的不均匀性使得预测模拟、过程控制十分困难。一些已考虑到菌丝的生长、细胞的分化的丝状真菌发酵的结构模型，在抗生素和酶制剂生产过程中是适用的。关于菌体形态方面的研究主要集中在菌体形态的分析，很少报道菌丝团内部结构和预测其生理状态。实际上从图像分析中获取关于菌体生理学方面的信息更为重要。Masahiro等人利用图形分析方法建立了人的角质细胞生长的在线监控系统，并将该系统应用到生物反应器的实际培养过程中。Miyanaga等人将图形分析方法应用于植物细胞培养过程中，有效地提高了产物的生成效率。利用计算机视觉技术量化微生物菌体的形态特征，是研究微生物发酵过程的有效途径之一。图像解析的分形、纹理熵算法及生物全息律等理论与方法将会对发酵过程研究带来新的契机。4.界面微生物生长模型1.界面的概念界面是指两个物体相态接触的分界层。如果两个相态接触紧密，就会有分子间相互作用，形成在组成、密度、性质上和两相有交错并有梯度变化的过渡区域。2.界面与微生物

第10页：界面的概念与丝状真菌生长

界面上微生物的生长和常态下的微生物生长有相似之处，例如：同样存在微生物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期；同样出现营养成分限制微生物生长的现象；温度、氧气、pH、电场、磁场等物理条件也影响到微生物的生长。由于界面的影响，界面微生物的生长又有自身特性：菌体形态、生物量以及代谢物质的变化受界面的影响；由于营养物质在界面上的富集作用，微生物可以在相对营养贫瘠的培养体系中生长；营养物质的在界面上的传递和常规不同；由于受到界面的影响，微生物的生物合成、活性调节等发生改变。3.界面上丝状真菌的生长丝状真菌的生长属于顶端生长。根据菌丝顶端生长的泡囊学说，细胞质的泡囊从内质网上水泡状的形式转移至高尔基体，在高尔基体内浓缩加工，并把泡囊的类内质网膜转化为类原生质膜，然后，泡囊从高尔基体释放并转移至菌体顶端，与原生质膜融合，释放它们的内含物到细胞壁中，这一融合过程不但使泡囊内含物进入膜壁之间，使泡囊内含物被用来合成细胞壁，而且泡囊膜也并入原生质膜，使原生质膜增加了体积，从而导致菌丝顶端的生长。大多数菌丝的分枝是在菌丝顶端之后的某一距离发生，新的分枝总是向前或朝向菌落的边缘，于是菌丝的整个系统像是松柏树枝，这一规律显示了真菌的顶端优势。菌丝的顶端彼此分离使菌丝间充满间隙，这保证了菌丝对营养的需求，同时它们会从存活菌丝营养耗尽的区域撤离。4.界面微生物生长动力学模型虽然研究界面微生物发酵系统的生长动力学有重要作用[85，86]，但生物量测定的困难和系统本身的不均匀性，使人们对其生长动力学研究甚少[87]。另外，由于生长方式的变化；氧和其它基质浓度梯度的变化；现场温度和界面形状的变化等都使模型的建立变得非常复杂。1.模拟系统中丝状菌生长的数字化描述图8-2界面模拟系统示意图

第11页：界面模拟系统与两相生长动力学

为便于讨论界面上微生物的生长变化，如图8-2所示，利用微生物在介质膜面上的生长来模拟界面上微生物生长。菌体从膜面上许多点同时开始生长，菌丝体不断地向未含菌落区延伸。菌落半径逐渐变大，并互相碰撞，造成菌体厚度的变化，但表面上并无变化。8.4.4.2两相生长动力学基于以上微生物的生长轮廓，可以以孢子开始伸出芽管为零点，将菌体的生长分为两个生长期，即较短的对数生长期和减速期。米根霉对称分叉模型对数生长期从孢子开始伸出芽管为起点。微生物菌落的生长用对称分叉模型来描述。当芽管伸长到一定长度时开始对称分叉，两个子菌丝形状相同，并以相同的速率伸长。菌丝的伸长率是一个常数，因此每根菌丝的长度随时间线性增加。一旦菌丝体长度又达到临界尺寸，它们又对称分叉。在界面上微生物生长中这个过程不断重复。由于活性菌丝的增长仅局限在活性段，因此总生物量的变化取决于活性生物量的增加。真菌生长的宏观生长模型为（8-1）式中μg是生物量的平均比生长速率，指从开始生成顶端到下一次分叉时的生长速率。虽然每一活性段以其特定的速率伸长，但平均比生长速率为一常数。由于活性生物量不能直接测量，所以将各个生长期内的活性生物量从总的生物量中分离出来，这样，二者的关系可表示为（8-2）

第12页：对称分叉模型与活性生物量

式中F是活性菌体占总生物量的分率。在对数生长期，利用对称分叉模型可以估算活性段的节数NA（8-3）式中b是分叉次数。总节数NT与活性段的节数NA之间的关系式为（8-4）活性段在所有的非同步、数目巨大的生长循环中均匀分散，例如在任何时间内活性段的平均长度等于非活性段长度的一半，而且活性段的生物量等于非活性生物量的一半。因此，F可以用以下方程表示：（8-5）XS为菌丝段质量，XN为总的非活性段的生物量。当菌丝体迅速分叉并延长时，F迅速约等于0.33。当第三次分叉时，F等于0.36。因此，在整个对数生长期内，F可以认为是0.33，并且维持不变。将（8-2）式取代（8-1）式中的XA，得到：（8-6）根据比生长速率的定义，可从（8-6）式得到：（8-7）积分，得：（8-8）从菌落的相互接触开始菌体生长就进入了减速期。在这个期间内仍符合菌体长度达到临界长度时开始分叉这一理论，但是考虑到一些顶端停止伸长和分叉，即它们变为非活性段，这个现象叫做顶端死亡。其实际上并没有停止物质代

第13页：减速期的顶端死亡与两相模型

谢，但却永久失去了延伸能力。当顶端死亡时，活性段变为非活性段，并且活性段所占的分率减少。两相模型含有两种顶端死亡：第一，培养进入减速期时顶端的大量死亡，这种衰亡速率以顶端存活因子L（进入减速期前后的活性段生物量之比）来表示。该因子允许减速期开始时的生长曲线斜率小于对数生长期终点的曲线斜率。L的最大值为1.0，表示所有的顶端全部存活，而且不受到生长年龄的影响。减速期开始的活性生物量分数（Fi）与在对数生长期维持的0.33和存活因子有关：(8-9)第二，模型认为在减速期内菌体的衰亡是沿着顶端开始的，这造成了在减速期内活性段的对数衰亡。(8-10)k是对数死亡系数,ta是对数生长期的最终时间。由（8-10）、（8-1）和（8-2）式，得：（8-11）其初始条件是，当t=ta时，XT等于对数生长期终点的菌体量XE，（8-14）代入方程（8-13），得：（8-15）由于菌丝在一个较宽范围内以恒定的速率延伸，因此可以认为在整个减速期内μg为常数，其大小与对数生长期内的μg相同，减速仅仅造成了菌体量X的降低。这样利用非线性回归可以从减速期内的实验数据确定生长参数L和k。

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