页数：79页文件大小：7.65 MB来源： 临床检验学ppt课件
本课件讲解血栓与止血的检验基础：先介绍血管壁结构与内皮细胞的抗血栓作用，再讲血小板的膜蛋白、膜脂质与粘附、聚集、释放、促凝功能，随后梳理凝血因子的分类特性、分子基础与凝血机制，最后讲血小板计数与血凝常规筛选试验。
第四章血栓与止血验验Test Of Thrombus And Hemostasis
血管壁止血作用示意图
静止期活化期
聚集血小板膜蛋白的作用GPIaCD49b与GPIIa复合，是胶原的受体GPIbCD42c与GPIX复合，vWF受体GPIcCD49f与GPIIa复合，Fn与层素受体GPIIaCD29与GPIa和Ic复合，胶原Fn受体GPIIb/IIIaCD41aFg的受体，也是vWF和Fn受体GPIVCD36TSP的受体GPV凝血酶的受体GPIXCD42a同GPIb粘附
血小板的膜蛋白结构模式图
膜磷脂
（2）膜脂质：主要成分为磷脂组成：鞘磷脂（SPH）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰、乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、溶血卵磷脂。a.作用：血小板活动时，PS从血小板膜内侧翻转至外侧，成为血小板第三因子（PF3）。b.TXA2及PGI2作用：相互拮抗作用，维持动态平衡c.产生PAF
骨架与管道系统
血小板细胞器和内容物
血小板聚集活化诱导剂
血小板止血功能示意图
一. 凝血因子的一般特性（一）依赖维生素K 凝血因子（二）接触激活因子（三）凝血酶敏感因子（四）其他因子
（一）依赖维生素K 凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ：共同特征：N末端含有γ羧基谷氨酸残基，此羧基依赖VitK在合成的最后环节转接上去。合成部位：肝脏
Ⅻ Ⅻa胶原固相激活激肽释放酶HMWK激肽激肽释放酶原XIIfXIXIa纤维蛋白原前激活物纤溶酶原激活物
（三）凝血酶敏感因子FⅠ、FⅤ、FⅧ、FⅩⅢ：共同特征：对凝血酶（Ⅱa）敏感。合成部位：F Ⅰ、Ⅴ——肝脏FⅧ ——不明FⅩⅢ ——肝、血小板
（四）其他因子FⅢ、FⅣ、vWF：合成部位：F Ⅲ——脑、胎盘、肺等各种组织FⅣ ——Ca2+vWF ——内皮、血小板
因子Ⅰ（即纤维蛋白原，fibrinogen,Fg）：由三对多肽链组成的对称性二聚体糖蛋白，三条多肽链分别是α(A)、β(B)、γ。Fg是血浆中含量最高的凝血因子，血浆中浓度为2.0~4.0g/L。其功能除直接参与凝血过程外，还具有其他多样功能，如与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合而倡导血小板聚集反应、参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等，Fg水平升高还是诱发心、脑血管疾病发病的重要因素。
FII(凝血酶原)是单链糖蛋白，分子量68,000，血浆浓度200mg/L。在多成分酶复合物凝血酶原酶作用下，凝血酶原分子苏氨酸位先断裂，释放含有Gla’a的活化肽（fragment1、2）；接着异亮氨酸断裂，产生由重链和轻链组成的α-凝血酶，活性位丝氨酸位于重链。
凝血酶原活化肽是近年来许多研究的主要内容。1985年Covers-Riemslag等发现，凝血酶原活化肽在凝血酶原激活过程中起调节作用。1987年Pieters等报道，它具有中和肝素的作用。
组织因子TF又称为组织凝血活酶（广泛存在于人体和动物组织细胞中，特别在脑、肺和胎盘组织中含量丰富，属于糖蛋白，分子量46,000。TF是由脱辅基蛋白和磷脂组成的脂蛋白，蛋白部分占有酶活性。TF的某些区域呈现传递膜蛋白特征，可能含有因子VII的细胞表面受体。纯化的脱辅基蛋白III单独不具备任何促凝活性，但与适量的磷脂重组后可重现促凝活性。
因子Ⅳ（即钙离子，Ca2+）：在凝血过程中Ca2+参与FⅪ与FXIII的活化，参与FⅨa与FⅧa、TF和FⅦa、FⅩa与FⅤa等复合物的活化。Ca2+主要促使活化的凝血因子与磷脂表面形成复合物，从而促进纤维蛋白的形成，最后使血液凝固。
因子V（factor V,FV）：FV单链糖蛋白，分子量330,000，血浆浓度30nmol/L。FV是FXa的辅因子，参与凝血酶原的激活。近年来，血小板FV也得到分离，在牛主动脉内皮细胞也发现有FV活性。FV可被凝血酶和FXa激活，但凝血酶可能是生理性激活剂。
FV缺陷有副血友病之称。FV缺陷有CRM＋和CRM－形式。FV缺陷病人通常仅有轻度出血症状。
因子VII（factor VII，F VII）F VII属于单链糖蛋白，分子量60,000，血浆浓度约为<10mg/L。它是由TF介导的凝血激活途径的启动酶，本身具有水解酶活性（通常表示为VII（a））。在适宜条件下，可以二异丙基氟磷酸（DFP）掺入FVII（a）丝氨酸活性位。
FVII（a）可进一步被因子Xa或凝血酶反馈激活，在异亮氨酸位分裂成双链形式（VIIa），重链含丝氨酸活性位（分子量约29500），轻链含Gla’s(分子量约23500)。在此激活反应过程中，无活性肽释放。FVII（a）经激活转变成FVIIa后，凝血活性增加约100倍。
因子VIII（factor VIII，F VIII）F VIII是由复合多肽链组成的糖蛋白，其分子量因测定方法不同差异很大（约200000），血浆浓度约1~1.5nmol/L。在血浆中，F VIII促凝蛋白（F VIII：C）与vWF紧密结合，难于纯化。近年来，人F VIII:C的cDNA密码得到解析，有关F VIII:C的结构和功能得到深入了解。
血友病A缺乏FVIII，可根据血浆FVIII：C活性分为重症（1％），中等度（1~5％）和轻度（5~25％）。
因子IX（factor IX，F IX）FIX又称抗血友病B因子，是单链糖蛋白，分子量57000，血浆浓度约80nmol/L。F IX可被F IXa或TF－F VII(a)复合物激活，两者反应都需要钙离子的存在。F IX的N端丙酸位断裂后产生由二硫键连接的双链形成，缬氨酸位断裂后也产生双链形成（F IXa），同时释放含碳水化合物的肽段（分子量9000）。
丝氨酸活性位位于C端（27000区）。由于FIXa失掉分子量9000的活性肽，分子量变成46500。
因子X（factor X，F X）F X(又称为Stuart-Prower因子)是双链糖蛋白，分子量约55000，血浆浓度约160nmol/L。F X是由重链（分子量37000）和轻链（分子量17000）组成，肽链之间由二硫键连接，轻链相当于其它维生素K依赖性凝血蛋白的N端，含有12个Gla’s。
F X既可被多成分酶复合物F X酶（tenase,由F IXa、F VIIIa、钙离子和磷脂组成）激活，又可被TF－FVIIa复合物激活。在F X酶或TF－F VIIa复合物的激活作用下，重链上的异亮氨酸位断裂，生成α-F X，同时释放分子量7000的肽段。α-F Xa具有自动水解酶的作用，可进一步使其丙氨酸位断裂，产生β-F Xa。
α-F Xa也可以水解苏氨酸位，但过程缓慢，可能不具有生理学意义。
因子XI（factor XI, FXI）：FXI是由两个等同的多肽链组成的的糖蛋白，分子量210,000，据cDNA密码核苷酸顺序分析，每个肽链由607个氨基酸残基组成，其中约58％的顺序与前激肽释放酶相同，FXI在循环中以非共价键与高分子量激肽原结合成双分子复合物，当接触活化反应发生时与表面结合。
FXI在α-FXIa限制性蛋白酶作用下，每个多肽链上的精369-异亮370位断裂，生成由重链（分子量48000）和轻链（分子量35000）组成的FXIa。每个轻链占有一个活性位，氨基酸顺序呈典型的丝氨酸蛋白酶。还原凝胶电泳分析显示，FXI与高分子量激肽原结合的部位位于重链部分。
该部位也是在FXIa、FXI激活过程中的钙离子结合位。
因子XII（factor XII, FXII）：FXII是单链糖蛋白，由536个氨基酸残基组成，分子量80000。FXII在血浆激肽释放酶限制性蛋白酶水解作用下产生两种活性酶形式，即α-F XIIa和β-FXIIa。在FXII活化过程中，首先精氨酸353位断裂，产生分子量80,000的双链活性α-FXIIa。
α-FXIIa是由重链（分子量50,000）轻链（分子量28,000）组成，肽链之间由二硫链连接。N端位于重链区，具有很强的表面结合能力。重链部分含若干折叠区域，也见于其他相关的蛋白（如纤维结合蛋白I和II型、蛋白C、FIX和FX），其中环饼区也见于纤溶酶原、组织纤溶酶原激活物、尿激酶和凝血酶原。
C端位于轻链，占有酶活性中心，其组成和结构与其他丝氨酸蛋白水解酶相似。
大多数FXII缺陷病人为常染色体显性遗传，也有为数不多的隐性遗传病例报道，两性均可受累。FXII缺陷不像其他凝血因子缺陷，病人无任何出血症状，相反，却常合并血栓栓塞性疾病，如首例发现的FXII缺陷病人Hagmen先生最终死于肺栓塞。实际上从那时起，接触活化凝血理论（内源凝血活化途径）就已面临着严峻挑战，现在发现TF-Ⅶa复合物可使FⅨ活化成FⅨa.，启动内源性凝血系统；
同时与FⅩ结合后形成FⅩa，促进凝血酶的形成，由此可解释FXII缺陷病人不引起出血，反而可导致血栓性疾病。
⑶前激肽释放酶（prekallilarein, PK）：PK是单链糖蛋白，由619年氨基酸残基组成，分子量为88000。与F XI相似，PK在血浆里以非共价键形成与高分子量激肽原结合成复合物，在接触活化反应过程中与反应表面结合。血浆PK经蛋白酶水解活化后可生成两种活性酶形式。
高分子量激肽原（high molecular wight kininogen, HMWK）HMWK也是糖蛋白，由626个氨基酸残基组成，分子量为110000。HMWK是接触活化反应中的非酶性蛋白辅因子。1985年Kitamura等阐明了人HMWK血浆的完全基因结构。
在血浆激肽释放酶的作用下，HMWK的两个内肽链断列，释放血管活性物质舒缓激肽，并生成由重链和轻链组成的双分子肽链。N端位于重链而C端位于轻链。重链与HMWK相同，不含促凝活性。轻链区域内富含组氨酸、赖氨酸和甘氨酸。这些具有很高阳性电荷的区域可能HMWK 与阴性表面结合。
除激肽释放酶外，α-FXIIa也显示激活HMWK，但激活速率慢。
二. 凝血因子的功能及其分子基础（一）纤维蛋白形成的基础（二）凝血酶形成的基础（三）凝血活化的基础
1.纤维蛋白的形成FibrinogenFibrinTThrombinFibrinopeptides A ＆BFibrin monomerdesAAdesBBFgαβγFibrinogen精-甘αβγ（1）分解：
（2）聚合FibrinogenFibrinTThrombinFibrin monomer FMdesAAdesBBFgαβγαβγSoluble FMFactor XIIIaSoluble fibrin monomer SFM
聚合（FM的聚合）：FPA和FPB从Fg中释放后，Fb-I和（或）Fb-II分子N端区的自身聚合位点被暴露。如FPA的释放，使Fb-I分子E区暴露出A位点，与另一Fb-I的D区相应位点结合；FPB的释放，Fb-II分子E区暴露出B位点，与相邻Fb-II的D区相应位点结合，形成纤维蛋白单体聚合物。
这种聚合物以氢键聚合，很不稳定，可溶于50mol／L（30％）尿素或1％单氯（碘）醋酸溶液中，故称为可溶性FM聚合物（SFM）。
（3）凝固FibrinogenFibrinTThrombinFibrin monomerdesAAdesBBFgαβγαβγFibrin PolymerFactor XIIIaCa2+：–CO-NH
凝固（交联纤维蛋白形成）：SFM在FXIIIa和Ca2+作用下，γ链分子和α链之间以共价键（-CO-NH-）交联，形成不溶性FM聚合物，此即纤维蛋白（fibrin，Fb）。
2.因子XIII的活化Activation of factor XIIIε赖氨酸连接
三. 凝血机制（一）内源凝血途径（二）外源凝血途径（三）共同途径
ⅫⅪⅨⅩa-Ⅴa-Ca2+-PF3ⅩⅢaⅫaⅪaⅨaⅩProthrombinThrombinFibrinogenFIBRIN CLOTFibrin monomerFigure 3. COAGULATION CASCADEⅧa-phospholipid-Ⅸa-Ca2+内源凝血系统（一）内源凝血途径（intrinsic pathway）FⅦa+TF固、液
Ⅹa-Ⅴa-Ca2+-PF3ⅩⅢaⅩProthrombinThrombinFibrinogenFIBRIN CLOTFibrin monomerFigure 3. COAGULATION CASCADETissue factor（TF）ⅦⅦaⅦa-TF-Ca2+外源凝血系统（二）外源凝血途径（extrinsic pathway）
Ⅹa-Ⅴa-Ca2+-PF3ⅩⅢaⅩProthrombinThrombinFibrinogenFIBRIN CLOTFibrin monomerFigure 3. COAGULATION CASCADE共同途径（三）共同途径
ⅫⅪⅨⅩa-Ⅴa-Ca2+-PF3ⅩⅢaⅫaⅪaⅨa+Ⅷa+PF3ⅩProthrombinThrombinFibrinogenFIBRIN CLOTFibrin monomerTissue factor（TF）ⅦⅦaⅦa-TF-Ca2+Figure 3. COAGULATION CASCADECa2+内源凝血系统外源凝血系统共同途径Injury to vessel exposes collagen fiber
血小板计数（platelet count , PC或PLT）血小板光镜结构血小板电镜结构
参于止血和凝血表面糖衣,凝血因子Ⅲ;颗粒内凝血物质.凝血因子Ⅲ ↓凝血酶原→凝血酶↓纤维蛋白原→纤维蛋白血细胞保护血管内皮，参与血管内皮修复，防止动脉粥样硬化血小板功能血凝块
一、计数方法显微镜手工计数法血细胞分析仪计数流式细胞仪分析
（100～300）×109/L二、参考范围PC＜20×109/L可引起自发性出血危险
“血凝常规”检验项目是一组凝血因子筛选试验，包括测定：白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）或活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶原时间（PT），凝血酶（凝固）时间（TT或TCT）和纤维蛋白原（Fg）定量。
白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）
37±3.3秒，受检者的测定值较正常对照值延长超过10秒以上才有病理意义。
血浆凝血酶原时间（PT）
PT秒值:平均值为12±1秒，男性11～13.7秒;女性11～14.3秒。超过正常对照值3秒作为异常。国际标准化比值(INR):INR=（患者PT秒/正常参比血浆PT秒）ISI，健康人PT的INR在0.8～1.5之间。
凝血酶时间或凝血酶凝固时间（TT/TCT）
待检血浆在凝血酶作用下，其纤维蛋白原转变为纤维蛋白，观察其凝固时间。
16～18s，超过正常3s以上者为异常。
纤维蛋白原（Fg）定量
用双缩脲比色法及热沉淀比浊法。
2～4g/L。
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