第1页：第七章 外源化学物质突变作用
第七章 外源化学物质突变作用
第2页：第七章内容提要
遗传毒理学：
- 第一节 基本概念
- 第二节 化学毒物致突变的类型
- 第三节 致突变作用机制和后果
- 第四节 机体对致突变作用的影响
- 第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法
第3页：遗传毒理学的概念
- 遗传毒理学 Genetic Toxicology
- 毒理学的一个分支，研究外源化学物及其他环境因素对生物体遗传机构的损害作用及其规律；主要目的是检测那些能引起 DNA 损伤的环境因素，研究其遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害。
第4页：突变、自发突变与诱发突变
- 突变 mutation
- 遗传结构本身的变化及其引起的变异，是遗传物质的一种可遗传的变异。
- 自发突变 spontaneous mutation
- 由于自然界中诱变剂的作用，或由于偶然的复制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。
- 诱发突变 induced mutation
- 由诱变剂诱发的突变。
第5页：致突变作用与基因突变
- 致突变作用／诱变作用 mutagenesis
- 广义概念是外来因素特别是化学因子引起细胞核中遗传物质发生改变的能力，且此种改变可随细胞分裂过程而传递；简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。
- 化学诱变剂 chemical mutagen
- 能诱发突变的化学物质。
- 基因突变 gene mutation
- 一个或几个 DNA 碱基对的改变。
第6页：遗传学相关基本概念
- DNA 与基因：基因（gene）、基因组（genome）
- 染色质（chromatin）与染色体（chromosome）
- 体细胞（somatic cell）和生殖细胞（germ cell）
- 基因型（genotype）与表型（phenotype）
- 细胞周期（cell cycle）、有丝分裂（mitosis）与减数分裂（meiosis）
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第11页：致突变的三种类型
- 基因突变（gene mutation）
- 染色体畸变（chromosome aberration）
- 非整倍体和多倍体（aneuploidy and polyploid）
第12页：基因突变的类型
一、基因突变（gene mutation）：
- 碱基置换 base-pair substitution
- 某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变，分为转换（transition）与颠换（transversion）。
- 移码突变 frameshift mutation
- 由于碱基的插入或丢失导致读码框架改变的突变。
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第15页：染色体畸变的类型
二、染色体畸变（chromosome aberration）指染色体的结构改变：
- 染色单体型畸变（chromatid-type aberration）
- 染色体型畸变（chromosome aberration）
具体表现包括：裂隙（gap）、断裂（break）、断片（fragment）和缺失（deletion）、微小体（minute body）、无着丝点环、环状染色体、双着丝点染色体、倒位（inversion）、易位（translocation）、插入（insertion）和重复（duplication）、辐射体。
第16页：染色体缺失与环状染色体形成图
染色体缺失及环状染色体的形成图；染色体插入和重复示意图。
第17页：染色体臂间倒位与相互易位图
染色体的臂间倒位与染色体相互易位示意图。
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第19页：非整倍体与整倍体
三、基因组突变：
- 非整倍体 aneuploid
- 细胞丢失或增加一条或几条染色体；缺失一条称为单体（monosome），增加一条称为三体（trisome）。染色体数目改变会导致基因平衡失调，可能影响细胞生存或造成形态功能异常，如 21 三体导致先天愚型（Down 氏综合征）。
- 整倍体 euploid
- 染色体数目的异常以染色体组为单位的增减，如三倍体（triploid，人体 3n 为 69 条染色体）、四倍体（tetraploid，4n 为 92 条染色体）；在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞存在，发生于生殖细胞的整倍体改变几乎都是致死性的。
第20页：DNA损伤的碱基损伤机制
致突变作用的机制——一、DNA 损伤与突变（一）碱基损伤：
- 碱基错配
- 嵌入 DNA 链
- 碱基类似物的取代
- 碱基的化学结构改变或破坏
第21页：DNA链受损与其他机制
（二）DNA 链受损：
- 二聚体的形成
- DNA 加合物（DNA adducts）形成
- DNA-蛋白质交联物（DNA-Protein crosslinks，DPC）形成
二、引起突变的细胞分裂过程的改变；三、其他的改变：对 DNA 合成和修复有关的酶系统作用可间接导致 DNA 损伤，诱发基因突变或染色体畸变。
第22页：突变的不良后果
突变的不良后果：
- 体细胞突变：癌变、致畸、衰老
- 生殖细胞突变：配子死亡、死胎、自发流产、先天畸形
第23页：机体修复DNA损伤的机制
一、机体修复 DNA 损伤的机制可分为两大类：
- 损伤耐受机制：DNA 遗传可绕过那些阻止 DNA 复制的 DNA 损伤。
- 修复机制：直接修复、切除修复（O6 甲基鸟嘌呤修复、光修复、错配碱基修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复）、复制后修复、呼救性修复（SOS 修复）。
第24页：遗传因素对致突变作用的影响
二、遗传因素对致突变作用的影响：
第25页：遗传学终点的概念
一、观察项目的选择——1．观察的效应终点类型：基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件，因此将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点（genetic endpoint）。
第26页：遗传学终点的五类
遗传学终点分为 5 类：
- DNA 完整性的改变（形成加合物、断裂、交联）
- DNA 重排或交换
- DNA 碱基序列改变
- 染色体完整性改变
- 染色体分离改变
其中③实际上指基因突变，④指染色体畸变。
第27页：成套观察项目的必要性
2．成套的观察项目：遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验，因为：
- 化学毒物种类和结构多样，致突变机制不尽相同，靶细胞也不一样（体细胞或生殖细胞），成套项目既要检测体细胞也要检测生殖细胞，并兼顾分子与细胞水平。
- 致突变物中仅少数具直接致突变作用，大多数需体内代谢活化后才具致突变作用；体内试验有完整活化系统，体外试验通过加入 S9 等模拟代谢系统弥补。
- 化学毒物致突变性有强有弱，弱致突变物在某些系统中容易出现假阴性。
第28页：成套观察项目的入选原则
遗传毒理学成套观察项目中试验可入选的原则：
- 选择的遗传毒性试验应包括 5 种类型的遗传学终点。
- 通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。
- 体内试验与体外试验配合。
- 应包括生殖细胞和体细胞。
通常先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行，并对阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害评价。
第29页：细菌回复突变试验
二、常用的致突变试验（一）细菌回复突变试验（Ames 试验）：使用鼠伤寒沙门氏菌原养型（his+）与组氨酸营养缺陷型突变株（his-），通过正向突变与回复突变，配合代谢活化系统观察受试物的致突变性。
第30页：微核试验
- 微核 Micronucleus
- 与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片，或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后单独形成一个或几个规则的次核，因比主核小故称微核。微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在分裂后期不能定向移动而遗留在胞质中；有丝分裂毒物使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在分裂后期被留在胞质中。
- 微核试验 MNT
- 观察受试物能否产生微核的试验，主要可检出 DNA 断裂剂和非整倍体诱变剂。
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第32页：
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第33页：染色体畸变分析与SCE试验
二、常用的致突变试验：
- （三）染色体畸变分析
- （四）姐妹染色单体交换试验（SCE）
第34页：其他常用致突变试验
二、常用的致突变试验（续）：
- （五）果蝇伴性隐性致死试验
- （六）显性致死试验
- （七）程序外 DNA 合成（UDS）试验
- （八）转基因动物致突变试验
- （九）哺乳动物细胞基因突变试验
第35页：阴性与阳性对照的设立
三、致突变试验中的一些问题（一）阴性和阳性对照的设立：
- 阴性对照
- 空白对照（不加任何处理）或溶剂对照，除无处理因素外与实验组完全相同，目的是获得实验的基础数据；如 Ames 试验阴性对照可了解细菌的自发回复突变率。
- 阳性对照
- 用已知能产生阳性反应的物质作对照，目的是证明实验方法可靠、验证实验者技术与鉴定能力、证实实验重复性；如 Ames 试验阳性对照未出现阳性，应考虑突变菌株问题或代谢活化能力不足，实验组数据可靠性亦大大降低。
第36页：体外试验的活化系统
（二）体外试验的活化系统：
- 哺乳动物细胞介导：使用完整细胞（特别是大鼠肝原代细胞）与测试细菌或细胞一起培养，有完整细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于 S9 等无细胞系统，但不如体内活化系统。
- S9：经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经 9000g 离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅助因子，主要含有混合功能氧化酶（MFO），是国内常规应用的代谢活化系统；缺点是随动物种属或器官不同而有差异，且含大量亲核物质可能影响试验敏感性。
- 纯化酶和基因工程：应用纯化细胞色素 P-450、谷胱甘肽转移酶及过氧化物水解酶可严格控制代谢条件但技术难度大；也可将人的细胞色素 P-450 基因插入组合细胞使其具有代谢活化能力。
第37页：致突变试验与致癌试验的关系
（三）致突变试验与致癌试验的关系：
- 已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用已在哺乳动物实验中证实。
- 发现人类接触致癌物与 DNA 加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。
- 传统长期致癌试验花费大、周期长，所用动物数量有限难以检出弱的致癌物，需要发展多种体内外短期试验用于致癌性筛检。
第38页：阴性结果的判定条件
（四）试验结果在毒理学安全性评价中的作用——阴性结果判定条件：
- 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量；如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量；哺乳动物细胞体外试验常选 LD50 或 LD80 为最大剂量；溶解度大、毒性低的化学物在细菌试验中可以 5000 μg／皿作为最高剂量。
- 各剂量组组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的化学毒物。
满足上述条件仍为阴性，才慎重下结论。
第39页：阳性结果的判定
阳性结果应具有剂量—反应关系，即随剂量增加致突变作用增加，并在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一，如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA 修复的实际后果尚不明确。
第40页：美国EPA三阶段试验方案
致突变试验举例——美国 EPA 毒物处（1996）提出的三阶段试验方案：
- 第一阶段测试化学物的遗传毒性：Ames 试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验（微核试验或染色体畸变试验）。
- 第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用。
- 第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。
在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺 DNA 相互作用的试验（睾丸细胞 SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等），也可进行显性致死试验；第二阶段阳性需进行小鼠特异座位试验；体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验阳性者需进行显性致死试验，第二阶段阳性再进行小鼠可遗传易位试验。
说明：原文标注为1936年，按文献通行年份应为1996年，此处已修正。
第41页：ICH 药品遗传毒性试验组合
国际协调组织（ICH，1997）对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合：
- 细菌基因突变试验
- 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞试验
- 体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验（骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓／外周血多染红细胞微核试验）
进一步研究可选择 DNA 加合物测定、DNA 链断裂检测、DNA 修复和重组试验等。三项标准试验为阴性通常可认为无遗传毒性作用；但构效关系提示可能具致癌性或致突变性而三项为阴性者，还需改进方法或增加试验项目。
第42页：我国食品与农药遗传毒理学试验要求
我国卫生部《食品安全性毒理学评价程序》（1994）要求：根据受试物化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点的不同，兼顾体外与体内试验及体细胞与生殖细胞原则，在 Ames 试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项；如其中一项为阳性，还应在备选试验（V79 细胞 HGPRT 基因突变试验、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、UDS 试验）中再选择两项。
《农药安全性毒理学评价程序》（1991）要求：Ames 试验和大肠杆菌回复突变试验、骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目；若有一项阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等中再选择两项进行。
