页数：43页文件大小：125.5 KB来源： 发酵与酿造工艺学ppt课件
本课件讲解工业微生物菌种保藏与复壮，先说明衰退源于变异及其与环境、传代次数的关系，再依次展开低温保藏、定期移植、石蜡油、干燥、甘油管、真空冷冻干燥和液氮超低温保存七类方法的原理与操作，最后介绍菌种提纯与复壮途径。
菌种衰退的基本原因是变异。变异是不可避免的，而减缓变异速度则是可能的。变异速度与菌种所处的环境有密切关系，不良环境条件能促进变异，频繁或过多传代也是造成衰退变异的重要原因。为菌种创造良好条件、减缓菌种衰退，这就是菌种保藏与复壮工作。
本章内容包括：
工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有所不同：要使菌种的生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定。当然做不到绝对不变，只是力求把这种衰退现象推迟、减缓到最低限度。
菌种保藏有许多方法，其共同目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。
低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的简单易行方法。缓慢冷冻时，胞外基质较快结冰形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡；如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，且胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡。
冷冻干燥法、超低温保藏法等都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理设计的。
现行的菌种保藏方法有下列诸种：
斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。
石蜡油低温保藏的具体操作：
为转接方便、控制接种量并保护菌种，通常将分生孢子、芽孢甚至菌丝体吸附于载体表面，放至干燥容器中进行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大（小）米等。
1. 沙土管法的制备步骤：
也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中，然后将沙土管抽真空干燥，管内砂土松散即表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内，干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，也可以不抽真空直接放干燥器内保存。
在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。不同抗生素产生菌的沙土管保藏年限如下：
| 菌种 | 保藏年限 | 备注 |
|---|---|---|
| 土霉素产生菌 | 18年 | 存活率稳定 |
| 链霉素产生菌 | 18年 | 存活率稳定 |
| 新霉素产生菌 | 22年 | 存活率稳定 |
| 利福霉素、卡那霉素、四环素产生菌 | 不宜长期保存 | 容易产生变异 |
保藏有效时间与菌种存活率的关系原文见图2-10，本页未提取到图形数据。
本页对应沙土管法一节，源文件仅保留节标题，原课件此处应为「保藏有效时间与菌种存活率的关系图」（图2-10）。
方法：3#滤纸剪成5mm×50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌；将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将滤纸条浸入菌悬液中充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。
方法：将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用；将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液（10⁸～10¹⁰/ml）；取1ml灭菌甘油与菌液充分混匀，使甘油浓度约为40%，于-20℃下冻存。
冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异；还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。
冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备菌悬液，使菌在冻结和脱水过程中起保护作用，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
3. 操作方法——（1）安瓿管准备：选取规格约直径8mm、高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次后烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。
本页为「（六）真空冷冻干燥法」保护剂一节的表格页，源文件仅保留节标题。结合上下文，原课件此处应为常用保护剂种类表（表2-8），具体种类与配比建议对照原课件核校。
（2）保护剂的选择及制备：冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多（列于表2-8），效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用效果更好。配制时注意比例、浓度、pH和灭菌方法：一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳为保护剂。
（3）菌种准备及分装：菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子要新鲜。每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起（勿刮起培养基）制成菌悬液；如用液体培养的菌种，需经离心收集并用灭菌生理盐水洗涤细胞，再用保护剂悬浮制成菌悬液。
悬液中菌数要求达到10⁸～10¹⁰cfu/ml为宜，悬液制备完成后尽快分装和冻结，分装时可用灭菌长滴管滴入安瓿管底部，装量依据冷冻干燥机效能而定。
（4）预冻与（5）冷冻干燥的关键参数如下：
| 操作环节 | 工艺参数 | 说明 |
|---|---|---|
| 预冻 | -30～-40℃，20～60min | 也可用干冰和无水乙醇冻5～10min |
| 干燥箱温度 | -30℃以下 | 随后逐渐升温以加速水分升华，但升温不宜过快 |
| 真空度 | 66Pa以下 | 应尽快达到 |
| 样品最终含水量 | 1%～3% | 以冻干样品呈酥块状或松散片状、样品温度接近管外温度为准 |
| 密封 | 真空下火焰烧熔密封 | 并用高频真空检测真空度 |
原文预冻温度写作「-30～40℃」，按冷冻工艺常理应为 -30～-40℃，此处已作修正。
（6）保藏及冻干管的启用：密封好的冻干管在4℃或-18℃下保藏。当需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧后迅速滴上冷的无菌水使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎管口，加入0.3～0.5ml液体培养基溶解冻干菌块成为悬液，用无菌滴管或接种环移至斜面或液体培养基进行培养。
4. 简易冷冻干燥装置：在缺乏真空冷冻干燥机的情况下，可以自己装配一个简易冻干装置（图2-11），主要由歧管（玻璃或金属管制成）、冰浴、冷凝器（水汽接收）和真空泵组成。冰浴用干冰（固体CO₂）和甲基溶纤剂致冷，干燥后期也可作温度控制用；冷凝器也要置冰浴中，必要时用一根U形玻璃弯管代用。安瓿管在冻干前也要预冻。
1）菌的质量：保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另外，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高；不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。
（2）保护剂：不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的，如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混合保护剂时死亡率大大减少。一般情况下，容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻，因此选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。
本页为「（六）真空冷冻干燥法」影响因素一节的分节标题页，源文件仅保留节标题。后续内容依次讨论干燥速度、空气、温度、含水量与复苏培养等对冻干存活率的影响。
3）干燥速度：实验表明慢速干燥比快速干燥存活率高。
| 干燥时间 | 存活率 |
|---|---|
| 6h | 67.3% |
| 3h | 59% |
（4）空气的影响：冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存。
（7）复苏培养：打开安瓿管后加入无菌水使冻干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。
菌种能否适宜冻干保存需经过实验证明：一般在保存1个月进行复苏培养，如果菌的成活率高于0.1%，即认为可用冻干保存法保存，以后6个月、2年、5年、10年再进行检查存活情况，以确定保存期的上限。
冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌＞放线菌＞真菌＞藻类，而菌丝体不宜用此法保存。
原文成活率写作「01.%」，按上下文应为 0.1%，此处已作修正。
原理：微生物在-130℃以下温度时新陈代谢作用停止、化学反应也消失，而液氮温度可达-196℃，在这种情况下可以长期保存。
1. 保护剂：与冷冻干燥保存一样，液氮保存菌种也需要保护物质。
| 保护剂 | 常用浓度 | 说明 |
|---|---|---|
| 甘油 | 10% | 使用方便、效果好，但有些菌对甘油敏感 |
| 二甲基亚砜 | 5%～10%（V/V） | 甘油效果不佳时可选用 |
| 二甲基亚砜＋蛋白胨 | 20%＋1% | 复合保护剂 |
| 吐温80 | — | 原文未标注用量 |
| 聚乙烯氮戊环 | 0.4mmol | 原文未标注体积基准 |
| 糖类 | 浓度需适当控制 | 也可作为保护剂 |
吐温80与聚乙烯氮戊环原文未给出完整浓度表述，本表按原文照录，未作推断补充。
2. 操作程序：
二、菌种的提纯与复壮包括：
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