页数：71页文件大小：440.0 KB来源： 家畜传染学ppt课件
本实验指导分基本技术、传染病实验室诊断技术、疫苗制造技术与抗体制备技术四部分，系统讲解消毒、免疫接种、剖检、细菌分离培养、药敏试验、鸡胚接种，以及新城疫、布病、口蹄疫等的实验室诊断方法。
家畜传染病学、禽病学实验指导：本指导用于配合家畜传染病学与禽病学课程的理论教学，系统训练动物传染病的实验室诊断与防疫操作技能。
目录。
第一部分 基本技术：一、消毒；二、免疫接种；三、剖检技术及病变检查要点；四、细菌分离、培养技术；五、药敏试验；六、病毒分离培养技术；七、鸡胚接种技术；八、动物试验技术；九、病原体的鉴定方法。
第二部分 传染病实验室诊断技术：一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术；二、减蛋综合征的诊断及抗体检测；三、马立克氏病琼扩试验；四、鸡传染性法氏囊病琼扩试验；五、鸡传染性喉气管炎的诊断；六、传染性支气管炎的诊断及防制；七、包涵体肝炎的实验室诊断；八、禽脑脊髓炎的实验室诊断；九、鸡传染性贫血的实验室诊断；十、禽霍乱的诊断；十一、鸡白痢的检疫；十二、鸡枝原体的检疫；十三、大肠杆菌病的实验室诊断；十四、禽流感的实验室诊断；十五、炭疽的诊断和防治；十六、布病的实验室诊断；十七、结核的实验室诊断；十八、巴氏杆菌的实验室诊断；十九、口蹄疫的实验室诊断；二十、兔瘟的诊断；二十一、乳胶凝集试验检测猪细小病毒；二十二、犬细小病毒的实验室诊断；二十三、间接血凝抑制试验测定猪瘟抗体；二十四、乳胶凝集试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体；二十五、乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病毒抗体；二十六、乳胶凝集试验测猪萎缩性鼻炎病毒抗体；二十七、猪圆环病毒的血清学诊断。
第三部分 疫苗制造技术：一、新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造；二、鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗的制造；三、鸡新城疫LaSota系弱毒疫苗的制造；四、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗制造；五、氢氧化铝胶苗的制造；六、动物脏器组织灭活疫苗的制造；七、油乳剂灭活疫苗的制造；八、猪瘟兔化弱毒苗的制备。
第四部分 抗体制备技术：一、传染性法氏囊病高免卵黄抗体的制备；二、抗新城疫高免血清的制备；三、猪瘟高免血清的制备及应用；四、抗体提纯技术。
第一部分 基本技术 一、消毒。
1.人员消毒：所有进入禽场生产区的人员必须在更衣室内更衣换鞋；场区入口应设喷雾消毒装置和消毒池，喷雾药物可用0.1%新洁尔灭或3%～5%来苏儿，使用新洁尔灭时应避免与肥皂或碱类接触；也可采用紫外线照射消毒。
2.禽舍消毒：消毒前必须彻底清扫与冲刷。先向空间喷洒雾状消毒剂使尘埃沉落；移出可移动设备洗刷消毒；用1%～2%热氢氧化钠、20%草木灰或10%～20%石灰乳洗刷墙壁地面；金属笼具冲洗晾干后用0.1%新洁尔灭喷洒或火焰喷射；最后密闭用甲醛熏蒸。
熏蒸配比：每平方米空间用甲醛20～40毫升，高锰酸钾为甲醛半量（2毫升甲醛、1克高锰酸钾、1毫升清水），放在大容量瓷器内。操作时先把盛有高锰酸钾的瓷器放好再加入甲醛，决不可将高锰酸钾加到甲醛中去，操作完立即离开现场。熏蒸2～4小时，延长至8小时更好，消毒后开窗排除余气，禽舍闭置1～2周后使用。
3.用具消毒：蛋箱、笼子、雏盒、工具先洗刷晾干，再放密闭房间内用甲醛熏蒸5～10小时。
4.孵化消毒：福尔马林法每立方米用30毫升福尔马林加15克高锰酸钾，经20～30分钟；新洁尔灭法配成千分之一浓度喷于种蛋表面；氯消毒法用含1.5%活性氯的漂白粉溶液浸3分钟；高锰酸钾法用0.5%溶液泡1分钟（现配现用）；红霉素法先加温至37.8℃再置于2～4℃红霉素溶液（每1000毫升含400～1000毫克）浸泡15分钟；氢氧化钠法用0.5%溶液浸5分钟可杀灭鼠伤寒沙门氏菌；庆大霉素法用每100毫升水含0.5克庆大霉素的溶液浸泡。
5.环境消毒：禽场周围每季度喷洒消毒一次，运动场每年更换一次表土或清扫后用火焰彻底消毒。
6.粪便消毒：最常用生物热消毒法即堆粪法。在距场100米以外设粪场，挖深约20厘米、宽约1.5～2米的浅沟，先堆非传染性粪便或秸秆25厘米厚，其上堆入欲消毒粪便垫草高达1～1.5米，外面再铺10厘米厚的非传染性粪便或麦草并覆10厘米厚沙土，堆置三个星期到三个月即可肥田。粪便太干加水，较稀加杂草，以促其迅速发酵。
7.带动物消毒：常用药物有过氧乙酸、新洁尔灭、抗毒威等，按说明使用。
理想消毒药物的特性：价廉易得；对人畜安全；易溶于硬水；对用具和纺织物不损伤；在空气中较稳定；无恶臭味；无残余毒性；在肉或蛋中不会积存；对杀灭大多数病原微生物有效。目前尚无一种消毒药能全部符合上述要求，应据具体情况选用。
| 消毒剂名称 | 使用浓度 | 使用对象 | 注意事项 |
|---|---|---|---|
| 苛性钠（火碱） | 1%～3%热溶液 | 禽舍、车船、用具等 | 对病毒性传染病消毒效果很好，但对皮肤有腐蚀作用，消毒后数小时用清水冲洗后才能放入家禽 |
| 生石灰 | 10%～20%乳剂 | 禽舍、车船、用具等 | 必须新鲜配制，用1%～2%碱水和5%～10%石灰乳混合液效果更好 |
| 草木灰 | 10%～20%热溶液 | 禽舍、车船、用具等 | 10公斤水加2公斤草木灰煮沸2小时过滤，用时再加2～4倍热水稀释 |
| 漂白粉 | 0.5%～20%，常用5% | 饮水、污水、禽舍、用具、车船、土壤和排泄物 | 含氯量应在25%以上，新鲜配制，对金属和衣物有腐蚀作用，消毒后彻底通风 |
| 来苏儿（石炭酸） | 2%～5% | 器械、用具和洗手等 | 用于含大量蛋白质的分泌物或排泄物时效果不够好 |
| 臭药水 | 5%～10% | 禽舍、土壤和用具等 | 即来苏儿粗制品，注意事项同上 |
| 福尔马林（甲醛溶液） | 5%～10% | 孵化器、蛋壳、蛋盘等 | 空气消毒每立方米用福尔马林20毫升加10克高锰酸钾和10毫升水，密闭至少半小时后彻底通风 |
| 新洁尔灭 | 0.1% | 蛋壳消毒、洗手 | 使用时不能接触肥皂或洗衣粉；可加25%亚硝酸钠防锈 |
| 过氧乙酸 | 0.2%～0.5% | 禽舍及除金属制品外的各种对象 | 对各种病原微生物杀灭效果好，价格低廉无公害，可喷雾或浸泡 |
二、免疫接种：用人工方法把有效疫苗或菌苗引入动物体内，激发机体产生特异性抵抗力，使易感动物转化为有抵抗力的动物。
（一）免疫程序的制订：没有任何一个免疫程序能适用所有地区或不同类型的养殖场。制订时至少考虑8个因素：当地疾病的流行情况及严重程度；母源抗体水平；上一次免疫接种引起的残余抗体水平；家禽的免疫应答能力；疫苗的种类；免疫接种方法；各种疫苗接种的配合；对动物全身健康及生产能力的影响。首次免疫时间主要取决于母源抗体水平——新城疫母源抗体滴度低要早接种，滴度高推迟接种效果更好。
（二）疫苗的种类：分灭活疫苗和活毒（弱毒）疫苗两大类，弱毒疫苗按生产过程又分湿苗和冻干苗。湿苗使用方便、免疫效果好但不能长期保存，冻干苗保存期长。
（三）疫苗的选择和使用：需要接种哪些疫苗主要取决于当地流行或可能流行的疾病种类，当地有该病流行或可能受到威胁时才接种，尤其是毒力强的活毒苗或活菌苗更不应轻率引入无病地区。流行较轻者可选用温和疫苗（如新城疫Ⅱ系、Ⅲ系），严重流行地区则选用效力较强的疫苗（如新城疫Ⅰ系）。初次接种应选毒力弱的品系，重复接种选用毒力较强的品系。
还应考虑不良反应：禽霍乱弱毒菌苗用于产卵鸡会引起产卵量短期下降；新城疫和传支疫苗接种可能造成潜伏的败血霉形体病严重暴发，此时应提前一两天连续服用药物。
影响疫苗质量的因素：
（四）免疫接种的途径和方法：常用方法有滴眼、滴鼻、翼下刺种、羽毛囊涂擦、滴肛或擦肛、皮下或肌肉注射、饮水法及气雾法。
（五）紧急接种：疫区及受威胁禽群可用免疫血清或疫苗进行紧急接种。在疫区内使用疫苗不但可防止疫病向周围蔓延，对新城疫及鸭瘟还可减少已发病禽群的死亡损失。但正处潜伏期或尚未明显发病的家禽有可能被促使发病和死亡，一段时间后发病及死亡数会迅速下降。
紧急接种应包括场内所有禽只，不留易感禽。发生新城疫时2月龄以上鸡可用Ⅰ系苗，幼龄鸡可用Ⅱ系。必须注意不是所有疫苗均可用于紧急接种，只有被证明确实有效的疫苗（新城疫Ⅰ系、Ⅱ系、鸭瘟弱毒疫苗）才能使用。一般先接种健康或无明显症状者，再接种可疑感染者或发病者。
（六）一般注意事项：
（七）免疫接种失败的原因分析：禽群经免疫接种后抵挡不住特定疫病流行，或效力检查不合格（如新城疫疫苗免疫后血凝抑制抗体滴度达不到应有水平、抽检攻毒保护率低于标准），均认为免疫接种失败。可能原因归纳如下：
三、剖检技术及病变检查要点：病理剖检既可验证临床诊断结果，又可为实验室诊断方法的选择提供参考。基本剖检方法：
四、细菌分离、培养技术：分离细菌一般多采取心血、淋巴结、肝脏或脾脏，雏鸡白痢可取胆汁或未吸收完的卵黄。病料应在病鸡自然死亡后立即采取并严格无菌操作，取好后尽快接种，不应久放。
培养基制备：普通琼脂取牛肉汤100毫升，加蛋白胨1克、氯化钠0.8克、琼脂粉2克，加热溶化后用NaOH调pH 7.8，15磅高压灭菌30分钟，冷至45℃倾注平皿，每皿约20毫升，4℃可保存1～2周；不加琼脂即为普通肉汤，每管2～3毫升，可保存数月。检查禽霍乱巴氏杆菌的荧光性菌落需用血清琼脂平板（加10%鸡或绵羊血清），检查溶血性需用血液琼脂平板。
接种方法：在无菌室或酒精灯下以烧热的铁片或剪刀烧烙病料表面，在烧烙处剪一小口，用接种棒勾取少量组织接入肉汤或在普通琼脂平板上划线，37℃培养18～24小时后观察生长情况，涂片染色镜检，或进一步纯培养后作生化试验、动物接种试验或药敏试验。
五、病原菌药敏试验：测定病原菌对抗菌药物的敏感性对临床治疗具有重要意义。常用方法有纸片法、快速敏感试验（葡萄糖指示法）和试管法。
（一）纸片法：操作简单、应用最普遍。
抗菌素纸片制备：将滤纸打成直径6毫米圆片，每100片装小瓶，160℃干热灭菌1～2小时或高压灭菌后60℃烘干。药物浓度为青霉素200单位/毫升、其他抗菌素1000微克/毫升、磺胺类10毫克/毫升、中草药制剂1克/毫升。每毫升药液加入100片纸片，冰箱浸泡1～2小时，可37℃温箱2～3小时干燥或真空抽干，干燥纸片可保存六个月。
培养基：肠道杆菌及葡萄球菌用普通琼脂平板；链球菌、巴氏杆菌或肺炎球菌用血液琼脂平板；磺胺类药物敏感试验用无蛋白胨琼脂平板。
试验方法：用白金耳取培养10～18小时的幼龄菌均匀涂抹于琼脂平板，待干后用镊子夹取药敏纸片平均分布（每板4～5片），37℃培养18小时后测量抑菌圈直径（包括纸片）。
| 药物类别 | 抗药 | 中度敏感 | 极度敏感 |
|---|---|---|---|
| 青霉素 | ＜10毫米 | 10～20毫米 | ＞20毫米 |
| 其他抗菌素及磺胺类 | ＜10毫米 | 11～15毫米 | ＞15毫米 |
| 中药 | ＜15毫米 | 15毫米 | 15～20毫米 |
抑菌圈标准按原文表格整理；若抑菌圈比标准敏感菌株记录缩小，表明该抗菌药物已失效。
（二）快速敏感试验——葡萄糖指示法：许多细菌分解葡萄糖产酸使pH改变。培养基中加入抗菌药物后，若细菌敏感则葡萄糖不被分解、pH不变、指示剂不变色；若不敏感则分解葡萄糖产酸，使溴甲酚紫由紫变黄。
操作：取普通琼脂15毫升，加入1%葡萄糖及0.6%溴甲酚紫指示剂0.7毫升，灭菌后凉至50℃加入菌液0.5毫升混匀倾注，凝固后贴药敏纸片，37℃培养24小时。纸片周围有细菌生长者呈黄色，不生长仍为紫色，测量抑菌圈直径同纸片法判定。
（三）试管法：将药物作倍比稀释观察不同含量对细菌的抑制能力。取无菌试管10支，第1管加肉汤1.9毫升，其余9管各加1毫升；吸取药液0.1毫升加入第1管，混匀后吸1毫升至第2管，依次移至第9管后弃去1毫升，第10管不加药作对照；各管加幼龄菌液稀释液0.05毫升，37℃培养18～24小时。凡无细菌生长的药物最高稀释管即为该菌对药物的敏感度。
敏感度参考值（微克/毫升，抗药/中度敏感/敏感）：磺胺类药＞1000/50～1000/＜50；链霉素＞20/0.1～0.2/＜0.1；青霉素＞20/1～10/＜1；多粘菌素、庆大霉素＞10/2～6/＜2；金霉素、土霉素、四环素、红霉素、新霉素、氯霉素、合霉素＞6/2～6/＜2。
影响药敏试验的因素：器材规格与精确度；培养基成分（琼脂浓度以1.3%～1.6%较合适，平板厚度以2～4厘米为宜，磺胺试验不能含蛋白胨）；菌种敏感度差异与接种量；标准液和被检液的配制方法；培养时间以37℃16～18小时为宜；pH值（新霉素、链霉素碱性环境活性最大，四环素族以酸性为佳，青霉素、氯霉素以中性为宜）。
六、病毒分离培养技术：病毒分离培养是确诊病毒性传染病的最可靠方法之一，包括鸡胚接种、动物接种和细胞接种分离培养，其中最简便常用的是鸡胚分离培养。
接种材料的制备：材料应新鲜无菌。将病料在无菌容器中剪碎研磨，用肉汤、生理盐水或特定稀释液作1:5～10稀释；按稀释后悬液量加入青、链霉素，使两者最终浓度达每毫升1000单位或微克，4℃作用1～2小时，离心沉淀后取上清液作为接种材料。
病料接种：用鸡胚分离多选9～12日龄发育鸡胚。接种前在照蛋器下检查鸡胚是否健康活泼并划出气室和接种部位，严格消毒后打孔，每胚接种0.1～0.2毫升，石蜡封口后置37℃继续孵育48～96小时。用动物分离时最好选用本种动物或自然易感动物，常用实验动物有小白鼠、豚鼠、家兔、大白鼠等；兔常肌肉或耳静脉注射1毫升，小白鼠、大白鼠、豚鼠常腹腔注射0.2～0.5毫升。
收获部位：不同病毒存在于不同部位，如新城疫病毒在尿囊液和羊水中、喉气管炎病毒和痘病毒在绒毛膜上含量最高；猪瘟病毒接种家兔后主要存在于血液、脾脏和淋巴结，狂犬病毒主要存在于脑和神经组织中，收获时应据此选取相应组织器官。
七、鸡胚接种技术：可用于分离培养病毒、枝原体及衣原体，还可用于病毒鉴定、效价测定、致病力测定及制造疫苗和抗原。
1.选胚：大多数病毒适于9～12日龄鸡胚，以白色蛋壳者为好，应发育正常健康活泼，来自健康无病且不含相应母源抗体的鸡群，最好选用SPF鸡胚或非免疫鸡胚。
2.照蛋定位：挑出死胚和弱胚，用红铅笔画出气室位置和接种位点，接种点应避开大血管、靠近气室边缘、离胚头约1厘米。
3.接种方法：
4.孵化观察与收毒：每天照蛋2次，24小时内死亡者多因创伤或细菌污染应弃去。孵化时间：新城疫、传支、减蛋综合征和法氏囊病毒48～120小时，传喉和马立克病毒48～96小时，痘病毒4～5天，脑脊髓炎病毒需孵化至出壳。收毒前放4℃冷冻36小时左右或-10℃以下速冻4小时（不得冻结）。每胚一般可收8毫升左右尿囊液。
注意事项：接种材料一般应按每毫升1000单位或微克加入青链霉素；接种点最好选在胚头左侧；注射口和气室孔均应用石蜡切实密封；死胚随时取出；冷冻时保持气室向上。
收毒步骤：鸡胚气室向上，碘酊酒精消毒后以无菌镊子敲开气室蛋壳，注意不要让卵壳碎屑掉入。尿囊液：撕去卵壳膜后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起，用巴氏吸管刺破绒毛尿膜吸取，可用镊子轻压羊膜和胎儿以防堵管；羊水：吸完尿囊液后将吸管插入羊膜腔吸取；绒毛尿囊膜：将卵内容物倒出后从卵壳内壁撕脱；胚胎：撕破卵壳膜和绒毛尿囊膜后夹起胚胎，剪断卵黄带取出。
接种后孵化的时间要求：新城疫病毒、支气管炎病毒、减蛋综合征病毒和法氏囊病毒48～120小时；喉气管炎病毒、马立克氏病毒48～96小时；痘病毒4～5天；脑脊髓炎病毒孵化至小鸡出壳。
五项注意事项：接种材料应按每毫升1000单位或微克加入青、链霉素；接种位点应避开鸡胚大血管和胚头以免刺伤造成损伤性死亡；接种点最好选在胚头左侧（因右手持注射器易向左倾斜）；注射口和气室孔均应用石蜡切实密封防止细菌污染；死亡鸡胚应随时取出以免细菌繁殖污染周围鸡胚，冷冻时保持气室向上。
八、动物试验技术：常用于病原微生物的分离、鉴定、免疫原性测定、致病力测定、保护力测定、感染谱测定、病原的继代保存或致弱、中和试验、半数感染量或致死量测定以及制造疫苗和免疫血清等。
常用实验动物：家兔、小白鼠、豚鼠、大白鼠、鸡和鸽子等，必要时使用本种动物（如猪病用猪、羊病用牛）。动物均应健康无病、不带有任何病原微生物，最好使用SPF动物，并对所试病原体敏感。
保定方法：家兔可用保定台、保定筒或徒手保定（一手压住臀部和后腿，另一手抓住肩部和前腿）；大鼠和小鼠用左手拇指捏紧双耳和颈部皮肤、手掌和其余手指握住背部；豚鼠同大鼠或小鼠，较大者左手捏住头颈部皮肤及背部和右手固定臀部后肢；鸡或鸽侧卧，右手压住翅根部和背部，左手握住两后肢大腿部。
接种方法与剂量：小白鼠一般0.2毫升，大白鼠0.5毫升，家兔和鸡1～2毫升，鸽子0.5毫升。
九、病原体的鉴定方法：各种病原微生物通过分离培养后，最终都必须通过病原鉴定才能得出确诊。鉴定一般包括以下内容：
第二部分 传染病实验室诊断技术 一、鸡新城疫的诊断及免疫监测技术。
（一）临床与病变要点：主要侵害鸡，其次火鸡、珠鸡和野鸡，鸭鹅等水禽不易感。体温升高到43～44℃，精神沉郁或闭眼嗜睡，腹泻呈黄白色或绿色，常摇头、嗳气发出"咯咯"声，口鼻有多量粘液，嗉囊内积液；病程稍长常有腿翅麻痹或头颈歪斜等神经症状。剖检特征病变是腺胃乳头突起部或粘膜上点状或斑状出血，肌胃粘膜出血斑点，肠道尤其是盲肠扁桃体和小肠粘膜出血及纤维素坏死伪膜，心、腹部脂肪及喉头气管等处出血斑点。
（二）病毒分离：材料应采自早期病例，扑杀后无菌采取脾、肾、肝、肺、脑或骨髓等组织；生前可用棉拭子取呼吸道或泄殖腔分泌物。制成1:5～10乳剂，每毫升加青、链霉素各1000～2000单位，冰箱作用2～4小时后离心取上清。
鸡胚接种：常用9～10日龄鸡胚，每份病料至少注入5个胚。照蛋划出气室位置并选择无大血管处标记；气室顶部和标记处消毒后各钻一小孔；注射器插入小孔约3毫米缓缓注入0.1～0.2毫升；石蜡封口后37℃培养，每天照蛋2次（24小时内死亡者弃去）；死胚置4℃冰箱气室向上，6～24小时收获尿囊液。
鉴定：取透明无菌尿囊液作血凝反应（96孔微量板或白瓷板法），如发生红细胞凝集，即用已知抗新城疫血清作血凝抑制试验（HI），出现抑制反应即可确诊。也可用鸡胚成纤维细胞分离，24～48小时出现细胞病变（细胞圆缩颗粒化、拉长呈蜘蛛网或干枝梅样），新城疫强毒在平皿培养中通常出现大而透明或红色蚀斑（2～4毫米）。
（三）血清学检查：循环抗体产生后病毒可从组织中迅速消失，慢性病例难以分离病毒，应通过特异抗体检查间接诊断。中和抗体较HI抗体维持时间长，但HI试验能在短时间内作大量测定，故常用HI试验。抗体滴度于感染后5～7天开始上升，15～20天达高峰；受强毒感染而耐过的鸡滴度可高达11（log2）以上，鸡群中出现较多高抗体鸡说明已受过野毒感染。
（四）β-微量法器材与试剂：
微量血凝（HA）试验操作：
β-微量HI试验操作：
注意事项：本法测得的HI值比标准全量法平均高0.65（log2）；每次测定应设已知滴度的标准阳性血清作对照；HI滴度在4（log2）的鸡保护率约50%，4以上达90%～100%，4以下非免疫鸡保护率仅9%；鸡群HI抗体水平以抽检样品的几何均值表示，平均水平在4（log2）以上表示为免疫鸡群。
全血平板法：
材料：白瓷板、标准滴管（每滴0.025毫升）、三用血色素管、三棱针；抗原用含Lasota系病毒的尿囊液经福尔马林灭活、聚乙二醇浓缩制成，使用时用PBS稀释至含32～64血凝单位，每10毫升稀释抗原中滴入10%柠檬酸钠0.1～0.2毫升（4℃可存放4～5天）；阴性鸡为未经任何免疫、β-微量法HI滴度在1:16以下者。
操作：白瓷板上划4×4厘米方格，每格加稀释抗原4滴（约0.1毫升）；刺破翅下静脉或鸡冠，用三用吸管吸取全血10微升于抗原液中充分搅拌，展开成直径3厘米液面，作用1～2分钟判定。
判定："2"表示2分钟内100%凝集、呈花斑状或颗粒状且背景澄清，判阴性（无抗体）；"1"表示部分凝集、背景不全清亮，判可疑；"0"表示2分钟内不凝集、血液与抗原均匀一致，判阳性（有抗体）。
注意事项：抗原应现用现配，大批检验前需用标准阴性鸡预试；宜在12～28℃下进行，低于9℃凝集缓慢，高于30℃洗脱加快。全血平板法阴性鸡HI滴度相当于1～3（log2），阳性鸡相当于5（log2）以上攻毒后90%以上保护。
卵黄HI试验：在蛋壳上打蚕豆大孔放尽蛋清，用注射器插入卵黄吸取0.5毫升于等量中性磷酸缓冲盐水或8%枸橼酸钠或16%氯化钠液中，混合后按血清β-微量法测定。判定时可从微孔板反面观察凝集图形，因卵黄液中洗脱较快应及时判定。本法可利用破壳蛋、畸形蛋或无精蛋，卵黄抗体与产蛋种鸡血清抗体一致，比同期入孵雏鸡抗体平均高1个滴度。
二、产蛋下降综合征（EDS-76）的诊断及抗体检测：病原是一种来自鸭但只危害鸡的腺病毒，可凝集鸡、火鸡和鸭的红细胞，在鸭胚尿囊液或细胞培养液中有很高的血凝价，故可用HA和HI试验检测病毒及其抗体。鸡感染后常无明显临床症状，仅表现突然产蛋下降（持续3周以上，降幅30%～50%），同时产软壳蛋、蛋壳颜色变浅、畸形蛋可达10%以上；一旦发病产蛋率很难恢复到发病前水平，很少死亡，无特征性病理变化。
（一）血清学诊断：
（二）病原学诊断：取症状明显鸡的输卵管组织研碎，用生理盐水1:10稀释后加青链霉素，接种10日龄鸭胚或鸡胚成纤维细胞；鸡胚接种需培养96小时左右，细胞培养约72小时，连续盲传2～3代后再作HA、HI或琼扩试验鉴定。
三、鸡马立克氏病琼脂扩散试验：国内外用琼脂扩散试验检疫马立克氏病，该法简便易行、毋须特殊设备，基层兽医单位、鸡场及养鸡专业户均可采用。
抗原制备：将病鸡皮肤红肿感染处的羽毛从贴近皮肤处剪掉，剪下带有羽囊的皮肤称重，加入二倍量pH 7.2磷酸缓冲盐水研磨，-20℃冻结后37℃融化，反复冻融4次，25000转/分离心15分钟，上清液加入0.01%硫柳汞防腐，低温保存备用；也可向生物药厂购买。
阳性血清制备：用已知标准羽囊抗原或经剖检确诊病鸡的新羽毛（剪下羽囊约5毫米）作抗原，与病鸡群慢性病鸡或康复鸡血清作琼脂扩散试验，出现清晰沉淀线者即为阳性血清。
操作：用含8%氯化钠的磷酸缓冲液配制1%琼脂溶液，倒入平皿制成2～3毫米厚琼脂板；按七孔图案打孔（中央孔径3毫米，外围6孔孔径2毫米，孔距3～4毫米）。
判定：抗原和抗体孔之间或血清孔与羽囊之间出现清晰致密沉淀线即为阳性，羽囊法中6根有一根出现沉淀线即判阳性；不形成沉淀线者为阴性。
注意事项：
溶液配制：
原文缓冲液配方文字排列错乱，此处按磷酸盐缓冲液常规配比整理，实际配制以生物药品厂说明书为准。
四、鸡传染性腔上囊病（IBD）琼脂扩散试验：本病1957年首次在美国特拉华州甘布洛城发现，又称"甘布洛病"，主要侵害雏鸡和幼龄鸡，表现为腔上囊和肠道炎症以及肾脏病变。目前检疫诊断较为快速简易、准确特异的方法是琼脂扩散试验。
抗原制备：用标准毒力腔上囊病病毒株鸡体传代腔上囊，按1:4磷酸缓冲生理盐水制成组织匀浆，经口和眼内感染3～5周龄易感鸡（每只约0.2毫升）；接种鸡发病后采取72小时的病变腔上囊，加PBS制成匀浆使细胞内病毒充分释放，冻融两次裂解，1000转/分离心60分钟，取上清加卡那霉素分装，-20℃保存。
阳性血清制备：用标准毒株连续三次间隔10～15天接种易感鸡，发病后恢复期采血测定效价，凡经1:64以上稀释仍与抗原出现明显沉淀线者为合格。
操作：
判定：标准阳性血清与抗原之间有明显致密沉淀线，或阳性血清沉淀线末端向毗邻受检血清孔内侧偏弯者，判为阳性；不形成沉淀线，或阳性血清沉淀线向受检血清孔伸直或向外侧偏弯者，判为阴性。
注意事项：
与马立克氏病琼扩的通用性：本试验的琼脂板也可用马立克氏病琼扩试验的琼脂板代替，两者操作方法与判定原则基本相同，区别只在于所使用的抗原不同。在基层实验室中，马立克氏病、传染性法氏囊病、包涵体肝炎和禽脑脊髓炎的琼脂扩散试验可共用同一套器材与琼脂板制备方法。
五、鸡传染性喉气管炎（ILT）的诊断：
1.临床学诊断：对急性病例很有价值。急性病例鼻孔有分泌物、呼吸时发出湿性罗音，继而咳嗽喘气，严重者咳出带血粘液，有时死于窒息；检查口腔可见喉部粘膜上有黄色凝固物附着、不易擦去；病鸡眶下窦肿胀、持续性鼻液、出血性眼结膜炎，迅速发展为消瘦、鸡冠发紫、排绿色稀粪，病程5～7天或更长。缓和病例仅表现生长迟缓、产蛋减少、流泪和结膜炎，临床不易诊断。
2.病理学诊断：眼睑肿胀、结膜充血出血或溃疡，眶下窦肿胀内有干酪样物；鼻腔、腭裂有黄色粘液或干酪样物；喉头气管粘膜充血出血、有黄色粘液，气管内有条索状干酪样物、血凝块或鲜血，具有诊断意义。
3.检查核内包涵体：在疾病早期（1～15天）取气管或眼结膜组织切片姬姆萨染色，约57%的病例可检出核内包涵体，固定时须用较低的pH值。
4.动物接种试验：用病鸡气管渗出物或组织悬浮液气管内接种易感和免疫两种小鸡，若易感小鸡发病而免疫过的小鸡不发病即可确诊。
5.鸡胚接种试验：取喉头气管连同分泌物剪碎研磨，加5～10倍灭菌生理盐水稀释过滤，每毫升加青、链霉素各20000单位，冰箱作用4小时后接种9～12日龄鸡胚绒毛尿囊膜，每胚0.1～0.2毫升；3～5天鸡胚死亡，剖检可见绒毛尿囊膜水肿增厚、有灰白色坏死斑和核内包涵体。也可接种鸡胚肾细胞单层，24小时内可检出多核细胞。
6.传喉琼扩试验：具有检出率高、特异性强、快速等优点。
六、传染性支气管炎（IB）的诊断：
七、包涵体肝炎（IBH）的实验室诊断：由鸡腺病毒引起，以肝脏受害为主并在肝细胞中形成核内包涵体为特征，多发生于1～2月龄雏鸡且肉鸡多见，总死亡率可达30%左右。
八、禽脑脊髓炎（AE）的实验室诊断：
九、鸡传染性贫血（CAA）的实验室诊断：本病目前还无较实用的简便诊断方法。
十、禽霍乱的诊断：主要侵害鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、野鸡等，在高温潮湿的夏季和气候剧变的春秋雨季发病较多。最急性病鸡常见突然发病倒地死亡，有时在采食或产卵时死亡，肥胖和高产鸡多见；急性病鸡体温升高达43℃以上、无食欲、缩颈闭眼、剧烈腹泻排出黄灰白或绿色稀粪、口鼻有粘液、鸡冠和肉垂发紫；慢性病鸡消瘦贫血、关节肿化脓或呼吸困难。剖检可见皮下组织和腹部脂肪有出血小点，肠道发炎以十二指肠最显著，肝肿大色淡黄有许多灰白色针尖大坏死灶。
（二）微生物学诊断：
十一、鸡白痢的检疫：由鸡白痢沙门氏杆菌引起，主要侵害雏鸡并引起大批死亡，成年鸡多属慢性经过并可经卵传染下一代，构成连续的传染链锁。本病尚无有效免疫方法，只有采取有计划的检疫、及时淘汰带菌鸡并结合综合卫生防疫措施才能控制或消灭。血清学检疫方法有全血平板凝集反应、血清平板凝集反应、卵黄平板凝集反应和卵黄（血清）琼扩沉淀反应等。
（一）快速全血平板凝集反应：
（二）血清平板凝集反应：用内径2毫米、长10～12厘米聚乙烯塑料管引流采血（三棱针刺破翅下静脉），火焰封口后37℃温箱2小时，1000转/分离心3～5分钟分离血清；玻板用蜡笔划成约1平方寸方格，每格检查一只鸡。操作为方格内加被检血清一滴和抗原一滴，用牙签充分混合，观察30～60秒钟，凝集者为阳性。本试验应在10℃以上室温中进行。
（三）卵黄平板凝集反应：抗原可在100毫升中加入1%结晶紫溶液1毫升，置4℃冰箱3～4天（每日摇动2～3次）即成淡紫色抗原。操作时蛋壳打蚕豆大小孔放尽蛋清，用注射器吸取卵黄液0.5毫升于等量16%氯化钠溶液中混匀，取一滴于玻板加标准染色抗原一滴，22～25℃室温下观察：
凡在两个"+"以上者均判为白痢阳性。
（四）蛋黄（或血清）琼脂扩散试验：琼脂1.5克、氯化钠5.0克、1%甲基橙0.02毫升、1%叠氮钠0.2毫升、蒸馏水加至100毫升，调pH至7.4后倾注平皿（每皿约25毫升）；中央打孔直径5毫米、周围6孔直径3毫米、孔距4毫米，加热封底。中心孔加鸡白痢沉淀抗原，周围孔加蛋黄。37℃温箱24～48小时后置光源下观察，凡蛋黄与抗原之间出现细长光滑致密清晰的白色沉淀线者判为阳性；相邻两孔均为阳性时沉淀线在交接处连成稍弯曲的倒V形。
十二、鸡枝原体（霉形体）的检疫：鸡霉形体病（MG、CRD）主要由鸡败血霉形体引起，临床特征为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出罗音，在群养仔鸡群（1～2月龄）中最易发生流行，死亡率可达30%以上，成年鸡多为散发及隐性感染。本病常通过患病鸡所产的蛋传给下一代，检疫方法以全血平板凝集反应最好。
抗原：用国际标准"S6"株败血性鸡支原体经牛心汤培养基制成的凝集反应平板染色抗原，2～15℃冷暗处保存，有效期半年。
判定标准：
全血或血清平板凝集反应须在1～2分钟内呈"＋＋"以上者为阳性；2分钟以后出现凝集或2分钟内出现"＋"者均为可疑，可疑者二周后重检。注意事项：抗原使用前必须振荡；每次检疫均须作阳、阴性血清对照；反应须在15～25℃进行。
十三、大肠杆菌病的实验室诊断：
十四、禽流感的实验室诊断：本病流行广、病原体血清型多且容易变异，感染鸡群临床表现多种多样，有时很难与其他鸡病区分，因此实验室诊断非常必要。按国家规定，本病只能由哈尔滨兽医研究所参考实验室进行诊断，主要包括病毒的分离和鉴定、血清学诊断（血凝抑制试验HI和琼扩试验AGP）。
1.病毒的分离与鉴定：取发病严重或死亡鸡的气管、脾脏及输卵管剪碎研磨，用生理盐水作1:5稀释，10⁴转/分离心30分钟，吸取上清加青链霉素（1000单位/毫升）于4℃作用1～2小时，绒毛尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2毫升。37℃孵育，弃去24小时内死胚，不死的胚于72小时全部取出放4℃冻死，大多数胚在接种后60小时左右死亡。收取绒毛尿囊液，用0.5%鸡红细胞测定血凝性，HA价可由5 log2到10 log2不等；若无HA价可再盲传1～2代，仍无血凝价者视为病毒分离阴性。
对有血凝性的尿囊液，应再用已知流感阳性血清、新城疫阳性血清及减蛋综合征阳性血清分别作HI试验：能被流感阳性血清所抑制而不被新城疫和减蛋综合征阳性血清抑制者即为禽流感病毒。有条件时还可用HA和NA因子血清作亚型鉴定。
2.HA与HI试验：HA试验用品为灭活的流感病毒（鸡胚毒）、生理盐水、0.5%鸡红细胞、96孔V型滴定板和可调式微量加样器，操作与新城疫病毒的HA试验完全相同。HI试验除已知对照血清为禽流感阳性血清、抗原为禽流感病毒8单位和4单位灭活抗原外，其他用品及操作与新城疫β-微量法HI试验相同；也可用卵黄代替血清测定鸡群HI抗体。
3.AGP试验：用pH 6.4的PBS（0.1 mol/L）制成0.8%琼脂板并含8%氯化钠，然后按常规方法操作。
十五、炭疽的诊断和防治。目的：掌握炭疽实验室诊断的步骤和方法，熟悉炭疽的治疗要点，学会炭疽的预防接种技术。
（一）生前检查：流行病学应了解当地以往有无炭疽发生、流行形式、发病季节、动物种类、发病死亡情况、尸体处理方式及近年预防接种情况；临诊检查除一般检查外应特别注意喉部、腹下等处有无肿胀及肿胀性质，病畜有无疝痛（应与真疝痛区别），粪便是否带血。
（二）实验室诊断：
炭疽杆菌与伪炭疽杆菌的鉴别：炭疽杆菌与伪炭疽杆菌有某些类似之处，可参照下表鉴别，其中运动力测定、荚膜形成、致病力以及卵磷脂酶试验较为重要。
| 鉴别方法 | 炭疽杆菌 | 伪炭疽菌 |
|---|---|---|
| 运动力测定 | 无运动 | 一般有运动 |
| 高浓度CO₂下培养于血清培养基 | 有荚膜 | 无荚膜 |
| 普通琼脂培养基上生长物 | 常成长链 | 常成短链 |
| 普通肉汤培养物 | 不浑浊，无菌膜 | 常浑浊，有菌膜 |
| 明胶穿刺培养 | 倒立松树样生长，液化缓慢 | 无倒立松树样生长，液化常快速 |
| 羊血琼脂平板培养 | 溶血弱或不溶血 | 溶血明显 |
| 发酵杨苷 | 发酵缓慢或不发酵 | 快速发酵 |
| 美兰还原试验 | 还原缓慢 | 还原快速 |
| 卵磷脂酶 | 产生量小 | 蜡样杆菌常呈强阳性，大量产生 |
| 对实验动物致病能力 | 有致病力 | 大多数没有致病力 |
（三）炭疽的预防接种和治疗：
1.预防接种：在疫区对易感染家畜每年应进行炭疽芽孢苗预防注射。
注射后一周产生免疫力，免疫期为一年。
2.紧急预防接种：适用于发生炭疽的核心地区，或对健康家畜及有被感染危险的健康家畜。
3.治疗：
十八（十六）、巴氏杆菌病的实验室诊断。目的：初步掌握巴氏杆菌病的微生物学诊断步骤和方法。
1.检查材料：大家畜取新鲜的实质器官（肝、脾、肾、患病的肺脏等）、管状骨、心血（焊封于毛细管内），另做心血和实质器官涂片数张；小动物或家禽可取完整的尸体。
2.镜检：病料涂片用美兰、革兰氏、瑞氏或姬姆萨染色后镜检，多杀性巴氏杆菌呈卵圆形、有明显的两极性染色，并可看到两极之间两侧的连线。血片用瑞氏或姬姆萨染色时两极菌呈蓝色或淡青色，红细胞染成淡红色（家禽红细胞含紫色的核）。
3.培养：鲜血琼脂上呈较平坦、半透明的露滴样菌落且不溶血；血清琼脂上生长丰盛，45℃折射光下可见荧光（Fg型呈蓝绿色带金光、边缘有狭窄黄红光带；Fo型菌落较大、呈桔红带金光、边缘或有乳白色光带）；普通肉汤中呈均匀混浊，以后有沉淀，振摇时呈辫状升起。从培养基上所作的涂片中大部分不表现两极染色，而常呈球杆状或双球状。
4.生化特性：靛基质试验阳性、胆汁试验阳性、不运动，发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖产酸，不发酵乳糖、卫茅醇、鼠李糖，45度折光检验呈蓝绿色或桔红色荧光。
5.动物试验：病料研磨成糊状用灭菌生理盐水稀释成1:5～1:10乳剂，皮下或肌肉注射0.2～0.5毫升（猪牛羊病料用小鼠或家兔，家禽病料用鸽、鸡或小鼠）。实验动物如于接种后18～24小时左右死亡，则取心血及实质脏器涂片检查并分离培养。剖检可见接种局部肌肉及皮下组织水肿发炎，胸腔和心包有浆液性纤维素性渗出物，心外膜有多数出血点，淋巴结水肿增大，肝脏瘀血（用鸡接种尚可见密布的小点坏死灶）。
十七、结核病的检疫。目的：掌握牛结核菌素变态反应的诊断方法。牛结核菌素变态反应诊断有三种方法，即皮内反应、点眼反应及皮下反应，我国主要采用前两种方法且最好同时并用。1985年以来我国逐渐推广改用提纯结核素诊断检疫结核病。
（一）老结核菌素变态反应：
1.工作准备：老结核菌素（O.T）；药品器械包括卡尺、酒精、来苏儿、脱脂棉、纱布、注射器、针头、煮沸消毒锅、镊子、毛剪、消毒盘、鼻钳、点眼管、记录表、工作服、帽、口罩、线手套及胶靴等；将牛只编号，术部剪毛。
2.皮内反应操作：
3.判定标准：
4.点眼反应：牛结核菌素点眼每次进行两回。
十八、布氏杆菌病的检疫。目的：初步掌握布氏杆菌病的细菌学、血清学诊断及变态反应等检疫方法。实验诊断材料可采取胎儿、胎衣、阴道分泌物、乳汁、血液、血清、动物尸体以及马的脓肿中脓汁等。
（一）细菌学检查：
1.染色检查：病料以绒毛叶渗出液、胎儿胃内容物及肺脏、阴道分泌物及脓肿脓汁以及培养物制成抹片，除革兰氏染色外应用鉴别染色法镜检。布氏杆菌为球杆菌0.5～0.7 μm×0.6～1.5 μm，无鞭毛、不产生芽孢、不呈两极浓染，抹片呈密集菌丛、成对或单个排列、短链较少，革兰氏阴性；虽不是抗酸性染色细菌，但可以抵抗0.5%乙酸等弱酸脱色。
2.培养：布氏杆菌在普通培养基上虽可生长，但更适宜肝汤培养基；有些菌株需血清或吐温40才能生长，故血清葡萄糖琼脂或吐温葡萄糖琼脂是较好的常规培养基。常用基础培养基每100毫升中可加入放线酮10毫克、杆菌肽2500单位、多粘菌素B 600单位及乙基紫（最终浓度80万分之一）制成选择培养基。同时接种两份，一份置于含10%二氧化碳的密封容器中以利于初分离。
3.动物试验：豚鼠最适宜用于分离检查。注射后3～4周已能在脾脏和淋巴结中找到细菌；每种病料至少接种豚鼠两只，一只3周剖杀、另一只6周剖杀，剖杀前采血作凝集反应（滴度1:5以上为阳性）。剖检时注意淋巴结肿大、肝坏死灶、脾肿大或结节、睾丸及附睾脓肿、四肢关节肿胀等；若剖杀前血清凝集反应阳性，即使剖检培养阴性也可诊断为布氏杆菌病。
（二）血清学诊断：动物感染布氏杆菌后首先出现凝集抗体，再过一段时间才出现补体结合抗体，最后产生变态反应性。补体结合反应高度特异，其阳性反应与感染的符合率比血清凝集试验高，用于鉴别注苗后和自然感染引起的血清学反应很有价值。
1.试管凝集反应：
判定标准：牛、马和骆驼血清凝集价1:100以上，猪、羊和狗1:50以上者判为阳性；牛、马和骆驼1:50，猪、羊和狗1:25者判为可疑。可疑家畜经3～4周重检，牛、羊重检仍为可疑判阳性；猪和马重检仍可疑但农场中未出现阳性反应及无临诊症状者判阴性。猪血清常有个别非特异性凝集反应，应结合流行病学判定。
2.平板凝集反应：最好用平板凝集试验箱，无此设备可用清洁玻璃板划成4 cm²方格（横排5格、纵排数列）。
操作：用0.2毫升吸管将血清以0.08、0.04、0.02、0.01毫升依次加于每排4个小方格内，吸管须稍倾斜并接触玻璃板；然后用抗原滴管垂直向每格血清滴加1滴平板抗原（1滴0.03毫升），或用0.2毫升吸管每格加0.03毫升。用牙签或金属棒将血清抗原混合均匀，一份血清用一根牙签，按0.01、0.02、0.04的顺序混合。混合完毕将玻板均匀加温至30℃左右，5～8分钟后记录结果。
判定等级：
平板凝集反应中加入抗原后的血清量0.08、0.04、0.02、0.01毫升，其效价分别相当于试管凝集价的1:25、1:50、1:100和1:200。判定标准与试管凝集反应相同，每批次试验须以阴、阳性血清作对照。
3.虎红平板凝集试验：属快速玻片凝集反应，抗原可与试管凝集及补体结合反应效果相比，且在犊牛菌苗接种后不久即呈阴性反应，对区别菌苗接种与动物感染有帮助。操作为被检血清和虎红平板凝集抗原各0.3毫升滴于玻璃板方格内，每份血清各用一根火柴棒混匀，室温（20℃）4～10分钟内记录结果；在对照正常时被检血清出现任何程度凝集均判阳性，完全不凝集判阴性，无可疑反应。
4.全乳环状反应（ABR）：用于乳牛及乳山羊布氏杆菌病检疫，以监视无病畜群有无感染，也可用于个体动物辅助诊断。抗原有两种，苏木紫染色抗原呈蓝色、四氮唑染色抗原呈红色。被检乳汁须为新鲜全脂乳，腐败变酸冻结者、患乳房炎者的乳汁、初乳、脱脂乳及煮沸乳汁均不适用。
操作与判定：取新鲜全乳1毫升加入小试管，加抗原1滴（约0.05毫升）充分振荡混合，置37～38℃水浴60分钟，小心取出勿使振荡立即判定。
5.补体结合反应：材料包括溶血素、补体、2.5%绵羊红细胞、抗原和阴阳性血清，稀释液用生理盐水，被检血清及对照血清1:10稀释并按畜别灭能30分钟（羊、马血清58～59℃，驴、骡63～64℃，牛、猪56～57℃，骆驼54℃）。溶血素使用两个工作量，补体使用一个工作量；布氏杆菌补反抗原实际应用稀释度应比滴定效价浓25%。正式试验每种成分加入0.5毫升、总量2.5毫升，每份被检血清设两管（其中一支不加抗原作对照），两次加温均为37～38℃水浴20分钟。
6.变态反应试验：布氏杆菌水解素专供绵羊和山羊检查之用。用细针头将水解素注射于绵羊或山羊尾褶壁部或肘关节无毛处皮内0.2毫升，注射正确时局部形成绿豆大小硬包。注射后20小时和48小时各观察一次，以反应最强一次为判定依据：强阳性为明显肿胀发红、一望而知；阳性为容易看出；弱阳性需触诊发现；疑似需与另一侧皱褶比较；阴性无任何变化。阳性牲畜立即转入阳性畜群隔离，可疑者30日后复检。
补体结合反应判定：正式试验加温完毕后立即作第一次判定，要求不加抗原的阳性血清对照管、阴性血清对照管及抗原对照管呈完全溶血；静置12小时后作第二次判定，要求溶血素对照管、补体对照管呈完全不溶血。被检血清不加抗原管应完全溶血，加抗原管按标准比色管判定——溶血程度0%～30%为阳性（+++～++++），40%～60%为疑似（+～++），70%～100%为阴性（－）。
十九、口蹄疫的实验室诊断。目的：初步掌握口蹄疫的反向间接红细胞凝集试验、补体结合试验、琼脂扩散试验等血清学诊断技术。根据临诊和流行病学诊断为口蹄疫后应进一步确定病毒型，因为疫苗及血清的正确使用有赖于定型。
口蹄疫材料采集保存运送：
（一）口蹄疫病毒感染相关（VIA）抗原琼脂免疫扩散试验：用于检测被检动物血清中是否含有VIA抗体（口蹄疫多型抗体），以证实是否感染过口蹄疫病毒，适用于易感动物检疫、疫情监测和流行病学调查。
材料准备：Tris-盐酸缓冲液（Tris 2.42克、NaCl 3.8克、NaN₃ 0.2克、无离子水加至100毫升，用HCl调pH至7.6）；平皿（直径5.5厘米）、外径4毫米金属打孔器、模板（一个中心孔和6个外周孔，孔径均为4毫米，中心孔边缘到外周孔距离4毫米）；VIA抗原；标准阳性血清用A或O型口蹄疫病毒高免兔血清。
操作：被检血清和阳性血清均56℃灭能30分钟；取琼脂糖1克加Tris-盐酸缓冲液100毫升彻底融化，吸取7毫升加入平皿制成3毫米厚琼脂板，凝固后加盖置湿盒4℃备用；打孔后中心孔加VIA抗原，1和4孔加标准阳性血清，2、3、5、6孔加被检血清；置湿盒于室温（20～22℃）自然扩散，分别于24小时、72小时和168小时观察。
判定：标准阳性血清与抗原中心孔之间形成沉淀线时，若被检血清与中心孔之间也出现沉淀线并与阳性沉淀线末端融合，判为阳性；若不出现沉淀线但阳性沉淀线末端向内弯向被检血清孔，判为弱阳性；若不出现沉淀线且阳性沉淀线直向被检血清孔，判为阴性。
（二）反向间接红细胞凝集试验：
（三）补体结合试验：
1.反应要素：溶血素（生药厂出品）；补体（新鲜健康公豚鼠血清或冻干补体）；2%公绵羊红细胞悬液；口蹄疫A、O、C、Asia型高免豚鼠血清；抗原为病畜水泡皮毒。
2.被检抗原制备（由已知血清鉴定未知病毒）：将发病牛、羊、猪的新鲜水泡皮病料洗净称重研磨，用生理盐水作成1:2～1:3乳剂，室温浸出1～2小时或4℃浸一昼夜，3000转/分离心10分钟，取上清液于58℃灭能40分钟即成被检抗原。
3.溶血素滴定：按一般程序进行，使用工作量为试验滴定度的4倍。若试验滴定度为1:4000，则使用工作量为1:1000（即稀释倍数除以4）。溶血素的滴定每1～2个月进行一次即可。
4.补体的滴定：滴定用1:20（即5%）补体，设7个剂量，于7支试管中分别加0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35毫升，每管补加生理盐水至0.5毫升，然后每管加工作量溶血素0.5毫升和2%红细胞悬液0.5毫升，37～38℃水浴15分钟，完全溶血的补体最小量即为滴定度。
补体的工作量是滴定度再加1%（习惯上叫两个单位）：如滴定度为0.2毫升（含2%纯补体），其工作量为3%。本补反试验要用四个补体量，如两个单位是3%，则其余三个量为三个单位3.5%、四个单位4%、五个单位4.5%。因此补体滴定度不能低于0.25毫升，否则5%的补体不能用。
5.毒型鉴定试验：准备实验就绪后进行病毒鉴定。操作步骤按毒型鉴定试验表进行——按A、O、C、Asia四个血清型别分组，每组依次加入被检抗原、已知血清和补体（分别为2、3、4、5个单位），37～38℃水浴20分钟后加入溶血素加红细胞，再37～38℃水浴30分钟判定。血清一般作1:3～1:5稀释。
做鉴定试验时须作血清的抗补体对照及抗原溶血和抗补体对照。对照试验按对照表设置——包括各型血清对照、正常血清对照、被检抗原对照、补体单位对照等，并以生理盐水补足总量。
6.结果记录：反应管完全溶血记"－"；阻止25%溶血记"+"；阻止50%溶血记"++"；阻止75%溶血记"+++"；完全不溶血记"++++"。全部反应时间结束后可立即评定，也可6～12小时后再评定一次。
原课件中毒型鉴定表与对照试验表的数字连排严重，此处仅保留可安全辨识的操作程序与判定符号说明，具体加样量请以现行操作规程为准。
（四）乳鼠中和试验：
1.试验材料：
2.试验方法：受检血清每1毫升加2毫升生理盐水稀释后，每只乳鼠颈部皮下注射0.2毫升；注射后24小时将小鼠分为四组每组三只并涂不同颜色，分别于颈部皮下注射标准O、A、C、Asia型鼠化毒各0.2毫升后放回原处与母鼠同养。同时每组设对照乳鼠2只（不注射血清只注射各型鼠毒），四组共用8只。观察期3～4天。
3.判定：乳鼠典型症状是呼吸急迫、前后肢麻痹延至全身，多在感染后18～30小时出现症状最后死亡。设被检血清能保护注射Asia型病毒的小鼠而不能保护其他型者，即判定为Asia型，其余类推。试验完毕应将病鼠及死鼠烧毁，鼠笼用3%氢氧化钠消毒，器械煮沸消毒。
（五）交叉免疫法：用新鲜送检毒以缓冲液或生理盐水冲洗两次，滤纸吸去水分后称重剪碎，加中性玻璃砂研磨成糊状，加缓冲液作成1:10悬液；室温放置40分钟（其间搅拌三次），3000转/分离心15分钟取上清备用。取豚鼠2～4只，用结核菌素注射器及24号针头给后肢跖部注射（直六针斜六针，每针穿过后再抽回孔道一半处注入），另外在跖部皮下注射一针并于跖面扎刺至刚出血后涂以离心沉淀物。接种后12小时开始红肿，再经12～60小时将跖皮采下继续传代，每代2～4只。
当野毒适应豚鼠引起第二期水泡后，如补体结合反应确定为A型，则一次接种豚鼠14～16只分为7～8组每组2只，两周后设对照豚鼠2只，再将各种A亚型标准病毒作成1:100稀释液在跖部穿3～4针观察结果；如A2组不发生水泡则属A2。本法是补体结合反应的良好补充，用于确定主型后进一步确定亚型。也可用牛作交叉免疫。
（六）口蹄疫和猪水疱病的鉴别诊断：
（七）间接血凝微量试验：每孔加稀释液25微升；第1列第1孔加阳性血清25微升并倍比稀释至第8孔；第2列同法加阴性血清；待检血清25微升依次加入第3、4列并倍比稀释；每孔加抗原25微升，振荡2分钟后1～2小时观察。以阳性血清出现八孔凝集、阴性血清八孔不凝集为准，以抗原全部凝集的最大稀释度为抗体滴度。
二十、兔瘟的实验室诊断：兔瘟也叫兔病毒性出血症，是1984年在我国发现的兔的急性病毒性传染病，传播快、发病率和死亡率极高。比较简便快速适用的方法是血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验。
（一）平板快速血凝和血凝抑制试验：材料为发病死亡兔的肝、脾或肾脏用生理盐水制成1:5悬液离心取上清、3%人O型红细胞悬液、兔瘟阳性血清、白瓷板和棉签。操作：白瓷板上划4×4厘米方格，一格滴加1:5脾肝悬液2滴、生理盐水1滴、3%人O型红细胞悬液1滴搅匀；另一格将生理盐水换成兔瘟阳性血清。轻轻晃动瓷板，2～5分钟判定——若第一格出现明显红细胞凝集而第二格不出现，即可诊断为兔瘟。
（二）微量血凝和血凝抑制试验：96孔V型滴定板每孔加0.05毫升生理盐水，吸0.05毫升1:5稀释待测肝悬液加入第1孔，倍比稀释至第11孔后弃去0.05毫升；每孔加0.05毫升1%人O型红细胞悬液，振荡半分钟后37℃反应45分钟观察。以红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为血凝价（定量测定）。另取一块板同法稀释病毒后每孔加兔瘟阳性血清一滴，振荡后37℃反应10分钟，再加红细胞悬液振荡后37℃反应45分钟；若血凝价比未加阳性血清者低2个滴度以上即可判为兔瘟阳性（定性测定）。
二十一、乳胶凝集试验检测猪细小病毒：定性试验取被测样品（血清、全血、乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴分别滴于载玻片，各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀搅拌并摇动1～2分钟，3～5分钟内观察。定量试验先将被测样品连续稀释，各取1滴依次加于玻片，再各加乳胶抗原一滴，并做阳性和阴性对照。判定：乳胶100%凝集、液体完全透明记++++；75%记+++；50%记++；25%记+；无凝集且液体完全不透明记－；出现++以上凝集者判为阳性。
二十二、犬细小病毒的实验室诊断：较简便实用的方法是HA试验和琼扩反应。
HA试验：取患犬粪便2克加入4倍量PBS，摇匀后3000转/分离心20分钟取上清备用；从猪耳静脉采抗凝血，用5倍量PBS以2000转/分洗涤3次，配成0.5%浓度悬液。操作在96孔V型滴定板上进行：每孔加0.05毫升PBS，吸0.05毫升粪便上清液加入第1孔，倍比稀释至第11孔后弃去0.05毫升；每孔加0.05毫升0.5%猪红细胞悬液，振荡后37℃反应1～2小时（或4℃反应3小时）判定。以红细胞完全凝集的粪便稀释倍数作为病毒凝集价。HI试验方法基本与新城疫HI相同，只是用猪红细胞代替鸡红细胞，反应温度为37℃1～2小时或4℃3小时。
二十三、微量间接血凝检测猪瘟病毒抗体：试剂为猪瘟病毒正向间接血凝抗原、猪瘟病毒阳性血清（中国农科院兰兽研所制备）、含0.3%兔血清的PBS（pH 7.0）、96孔V型微量滴定板和微量加样器。操作：每份待测血清用8个孔，每孔先加PBS 25微升，取待测血清25微升加入第1孔后倍比稀释至第8孔弃去25微升；每孔加间接血凝抗原25微升，振荡1～3分钟，室温（20℃）反应60～90分钟判定。
猪瘟兔体交互免疫试验：选体重1.5千克以上健康家兔4只分两组，试验前3天开始每8小时测体温。采病猪淋巴结和脾脏称重研磨作1:10～1:5悬液，每毫升加青链霉素各1000单位，每只兔肌肉接种5毫升（用血液则加抗凝剂不稀释每头接种2毫升），对照组不接种。7天后用猪瘟兔化弱毒1:20～1:50稀释液静脉注射试验兔和对照兔各1毫升，每6小时测体温连测3天。若试验组接种病料后无热反应、接种兔化弱毒后也无热反应而对照组发生定型热反应，则诊断为猪瘟。
二十四至二十六、乳胶凝集试验：以下三种疫病的抗体检测均采用同一种乳胶凝集试验模式。
物品试剂：相应病毒致敏乳胶抗原（分别为PRRS病毒、PRV、猪萎缩性鼻炎病毒致敏）；对应的阳性血清、阴性血清；稀释液；96孔V型板；载玻片；微量移液器；待测样品。
操作术式：
结果判定：乳胶100%凝集、液体完全透明记++++；75%凝集记+++；50%凝集记++；25%凝集记+；没有凝集且液体完全不透明记－；出现++以上凝集者判为阳性凝集。
伪狂犬病的动物接种（仅用于PRV检查）：可选取家兔、大鼠等实验动物，多用家兔。取脑和脊髓称重、研磨、稀释、加双抗、静置或离心取上清液，经皮下、肌肉或脑内接种。家兔接种后约36～48小时出现精神狂暴、惊恐、呼吸促迫，在接种部发生典型的奇痒症状，这种症状仅维持几个小时，最后角弓反张、抽搐死亡，一般常于夜间死亡，死兔口中有咬下的接种部位被毛。
二十七、猪圆环病毒抗体ELISA检测：猪圆环病毒抗体的ELISA试剂盒及其方法属于生物技术领域，经特异性、敏感性、重复性等指标检验后用于血清样品检测，具有良好的特异性、可大量生产且检测成本低廉，与美国IDEXX公司ELISA试剂盒的检测符合率为96%（美洲型检测符合率100%）。
试剂盒组成：ELISA板条；20×洗涤液（W）；20×血清稀释液（D）；酶标二抗反应液（E）；显色液（A）；双氧水（H₂O₂）；2 mol/L硫酸终止液（S）；PRRSV标准阳性血清（P）；PRRSV标准阴性血清（N）。
使用步骤：
判定：检测样品OD₄₉₀/已知阴性血清OD₄₉₀＞2.1，且已知阳性血清OD₄₉₀＞1.0，即可判为阳性。
第三部分 疫苗制造技术 一、鸡新城疫Ⅰ系弱毒疫苗的制造：
1.毒种：由农业部兽医药品监察所供给，条件是：对鸡胚的最小致死量不低于10⁻⁶/毫升，鸡胚于接种后24～72小时内死亡、胚体病变明显、对红细胞凝集在1:80以上；对鸡的最小免疫量不低于10⁻⁶/毫升；安全、无菌。
2.制造方法：
3.疫苗检验：无菌检验（抽5瓶应无细菌生长，同时注射小白鼠每只皮下0.2毫升观察10天应全部不死）；安全试验（4～12月龄未经免疫健康鸡3只，每只肌注100倍稀释疫苗1毫升，观察10～14天应无反应或有轻度反应且14日内恢复）；效力试验（试验组每只肌注1000倍稀释疫苗1毫升，10～14天后与对照一起用强毒攻击，免疫鸡应全部健活而对照全部发病并至少死亡2/3）。
4.使用与保存：专供2个月以上鸡使用、初生雏鸡禁用；稀释100倍后刺种或皮下注射0.1毫升，也可稀释1000倍肌注1毫升；稀释后须冷藏当日用完；注射后3～4天产生免疫力，成年鸡免疫期1年、2月龄鸡半年。自鸡胚液收获日起，-15℃不超过20天，15～25℃不超过14天，25～30℃不超过7天。
二、鸡新城疫Ⅱ系弱毒疫苗制造：
（一）毒种：由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供给。制苗用毒种属弱毒力毒株，必须符合下列标准：
毒种保存：合乎标准的毒种保存在-15℃，湿毒应不超过1年半继代1次，冻干毒不超过六年继代1次；湿毒和冻干毒在0～4℃保存均不应超过4个月继代1次。
毒种继代：将毒种用灭菌生理盐水稀释10⁻⁴～10⁻⁵，以0.1毫升接种于10日龄鸡胚尿囊内（继代鸡胚所用鸡蛋应来自未感染过鸡新城疫及未经预防注射的健康鸡群）；选接种后72～120小时内死亡且病痕显著者分别收获鸡胚液，每管分别用血清琼脂斜面及厌气肉肝汤各1份作无菌检验（培养96小时须无菌），并做红细胞凝集试验。将无菌且凝集价在1:640以上、EID50达10⁻⁷/0.1毫升的鸡胚液混合分装于安瓿保存，注明收获日期、毒种代数；也可加等量5%蔗糖脱脂奶冻干。
毒种无菌检验：抽取分装后毒种5瓶，用血液琼脂斜面、改良沙氏培养基或不滴定pH普通琼脂斜面各2管每管接种0.2毫升；另以50～100毫升普通肉汤及厌气肉肝汤各1瓶分别接种0.5～1毫升，无细菌生长即可用作毒种。
（二）湿苗的制造：
1.鸡蛋的选择和孵化：宜采用受精率较高、确为健康鸡群所产的新鲜鸡蛋，清除蛋壳外污物并用消毒药液擦拭干净，置38.5～39℃孵卵箱孵化，相对湿度最好保持60%～70%。
2.毒种接种：以10⁻⁴～10⁻⁵稀释的毒种0.1毫升接种于孵育10日龄发育良好的鸡胚尿囊内，接种后将钻孔用蜡封闭，置37℃孵育，此后可不必翻卵。
3.照蛋与冷却：接种后72小时以前死亡者弃去不用；72小时后每4～8小时照蛋一次，将死亡鸡胚随时取出，至96～120小时不论死亡与否全部取出，气室向上直立置于0～10℃冷却。
4.鸡胚液收获：鸡胚于0～10℃冷却4～24小时后取出，气室部位用碘酒消毒，无菌剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（注意勿使卵黄破裂），吸出鸡胚液，每若干胚混合为一组置于灭菌瓶，每毫升加入青霉素500单位、链霉素500微克后放冰箱处理。同时应逐个检查鸡胚，胎儿腐败及鸡胚液混浊者弃去。
5.分装：经无菌检验后将鸡胚液混合均匀分装于安瓿，注明疫苗名称、批号及装量；若干支安瓿装盒并附使用说明，每盒粘贴标签注明制品名称及制苗弱毒株号、批准文件、批号、包装量、检验号码、用法、保存方法、制造日期及厂名等。
注意事项：生产过程中应特别注意不要混入或污染鸡新城疫强毒及其他鸡新城疫弱毒，所有过程须详细记录于专用表册。
（三）疫苗的检验：
1.无菌检验：每批疫苗任抽5～15瓶组成5组。湿苗应无细菌生长；冻干疫苗有菌生长时应作杂菌计数和病原体鉴定，并作鸡白痢等沙门氏菌检验应为阴性。杂菌计数：每克组织（鸡胚液和胎儿混合疫苗每毫升按1克计）的非病原菌应不超过1000个；污染霉菌亦计入杂菌数，菌数不超过规定时亦可出厂。
2.安全检验：①将疫苗按实含组织量10倍稀释，尿囊内接种10日龄鸡胚10个每胚0.1毫升，接种后24～72小时内鸡胚死亡率不超过20%为合格；若两次检验鸡胚均在48小时内全部死亡且确由接种物引起，判为不安全并报废。②用确无母源抗体的2～7日龄雏鸡20只分两组，第一组10只每只鼻孔内滴入5倍稀释疫苗两滴（约0.05毫升），第二组不接种作对照，同样条件分开饲养观察10日，任何一组不得有5只以上死亡；两组死亡数相等或第一组较少判合格，第一组较第二组多但未超过2只亦可判合格，否则可重检1次。
3.效力检验：①用生后1～8个月健康鸡8只采血作抑制红细胞凝集试验，证实对新城疫不具免疫力；用5只鼻孔内滴入100倍稀释疫苗2滴，10～14日后与另3只对照鸡同时肌注强毒1毫升（5个月以下鸡用1～5万倍稀释、5个月以上用1000倍）；观察10～14日，5个月以下者对照鸡应全部发病死亡、5个月以上者对照鸡全部发病并最少死亡2只，免疫鸡须全部健活。②用10日龄鸡胚检验：疫苗稀释成10⁻⁶、10⁻⁷、10⁻⁸三组每组接种5胚每胚0.1毫升，收获48～120小时死亡胚及120小时活胚的胚液测血凝价，1:160以上判为感染，计算EID50≥10⁻⁷/0.1毫升为合格。
4.物理性状与保存：湿苗为淡白色或淡红色澄清液体，安瓿底部可有少量沉淀，混浊、变色、有异物或异味者废弃。湿苗自收获日起：-15℃不超过1年，0～4℃不超过3个月，10～15℃不超过20日，16～25℃不超过14日，26～30℃不超过7日。冻干苗：-15℃不超过2年，0～4℃不超过8个月，10～15℃不超过3个月，25～30℃不超过10日。
（六）附记事项：
1.胎儿病痕：接种后72小时死亡的鸡胚多为全身充血；72～120小时死亡者除全身充血外在头、胸、背、翅及趾端有出血点；120小时以后死亡者除上述病痕外或呈发育不全、卷曲成团、失水干硬等病变。
2.试验用鸡要求：用生后1～8个月的鸡，同批试验鸡的年龄、体重、营养状况不得有显著差别；使用前采血作抑制红细胞凝集试验，确证未感染过鸡新城疫也未经预防注射（抑制凝集价为0）方可使用。
3.红细胞凝集试验（试管法）：将毒种用生理盐水作倍比稀释（1:10至1:1280）分别加入小圆底试管，每管0.5毫升，另设生理盐水对照；每管加1%鸡红细胞悬液0.5毫升，置20～30℃ 15分钟后检查，以红细胞凝集50%的稀释度作为判定终点。红细胞采取健康鸡血液以生理盐水洗涤3～5次（3000转/分离心），配成1%悬液应用。
4.抑制红细胞凝集试验：将试验鸡血清稀释成不同倍数加入试管，再加入已测定凝集价的病毒稀释液（如凝集价为160倍则按倒退二管取40倍稀释），振荡后静置5～6分钟再加红细胞；免疫鸡血清能抑制病毒与红细胞凝集，健康鸡血清则无作用，以凝集50%的稀释度为判定终点。
5.微量血凝试验：微量凝集板上每孔加生理盐水1滴（0.025毫升），用稀释棒蘸取被检鸡胚液1滴从第1孔起倍比稀释，最后弃去1滴；每孔加1%鸡红细胞悬液1滴并设红细胞对照孔，振荡后室温30分钟左右观察，以凝集50%的稀释度为血凝价终点。
6.微量抑制血凝试验：先测病毒血凝价，再每孔加生理盐水1滴后倍比稀释被检血清；每孔加已稀释病毒（4个血凝单位，如血凝价1024则稀释256倍）1滴，振荡静置3～5分钟后每孔加1%红细胞悬液1滴，振荡后室温30分钟观察。抑制血凝价4倍以内为阴性、8倍为可疑、16倍以上为阳性（疫苗检验用鸡抑制血凝价须为0）。
7.鸡白痢等沙门氏菌的检验：将被检物接种到普通肉汤和厌气肉肝汤培养基中，37℃培养24～48小时，选生长旺盛的好气、厌气培养液各1～2管分别用1～2个S·S琼脂平皿划线，37℃培养18～24小时；挑选无色、半透明、边缘整齐、光滑、稍呈隆起的小菌落与鸡白痢阳性血清作玻片凝集反应，2分钟内出现凝集者即为阳性。如无可疑菌落或菌落太小不易辨认，可继续培养24小时后挑选；仍无可疑菌落者可不作凝集试验即判阴性。
S·S琼脂配方：乳糖10克、牛肉膏5克、蛋白胨5克、胆盐10克、枸橼酸钠10～14克、枸橼酸铁0.5克、琼脂25克、0.5%中性红水溶液4.5毫升、0.1%煌绿溶液0.3毫升、蒸馏水1000毫升。
8.两种参考免疫程序：
三、鸡新城疫LaSota系弱毒疫苗制造：
（一）毒种：由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供给。制苗用毒种属弱毒力毒株，标准与Ⅱ系相同——对鸡胚10倍稀释尿囊内接种0.1毫升，鸡胚应于24～120小时内死亡70%以上、胎儿有明显病痕、红细胞凝集价1:640以上；对1月龄雏鸡滴鼻最小免疫量不低于10⁻³/滴；对10日龄鸡胚EID50不低于10⁻⁷/0.1毫升；对初生雏鸡不致病；须无菌；经免疫血清中和后不引起鸡胚死亡且血凝反应阴性。
毒种保存与继代：-15℃保存的湿毒不超过1年半继代1次，冻干毒不超过六年继代1次；0～4℃保存均不超过4个月继代1次。继代时将毒种用灭菌生理盐水稀释1～10万倍，以0.1毫升接种10日龄鸡胚尿囊内，选接种后72～120小时内死亡且病痕显著者收获鸡胚液，无菌检验培养96小时须无菌，并将对1%鸡红细胞凝集价1:640以上、EID50达10⁻⁷/0.1毫升的鸡胚液混合分装保存；也可加等量5%蔗糖脱脂奶冻干。
（二）湿苗制造：鸡蛋选用受精率高、健康鸡群所产的新鲜蛋，38.5～39℃、相对湿度60%～70%孵化；以10⁻⁴～10⁻⁵稀释毒种0.1毫升接种10日龄鸡胚尿囊内，石蜡封孔后37℃孵育；72小时前死亡者弃去，72小时后每4～8小时照蛋，至96～120小时全部取出置0～10℃冷却；冷却4～24小时后无菌吸取鸡胚液，每毫升加青霉素500单位、链霉素500微克，分组作无菌检验后分装安瓿。
（三）检验：无菌检验、安全检验（10倍稀释尿囊内接种10日龄鸡胚10个，24～72小时死亡率不超过20%；2～7日龄雏鸡20只分组试验）、效力检验（100倍稀释疫苗滴鼻1滴后强毒攻击，或用鸡胚测EID50≥10⁻⁷/0.1毫升）及物理性状检验，各项要求与Ⅱ系疫苗一致。
注意事项：生产过程中应特别注意不要混入鸡新城疫强毒及Ⅰ系毒。
（四）疫苗的保存及使用：
1.湿苗的有效保存期（自鸡胚液收获日期算起）：-15℃保存最长不超过1年，低温结冻保存的疫苗在一年期限内的后3个月中产品出厂前必须按效检方法用鸡胚效检1次，合格的疫苗1个月内必须出厂；0～4℃不超过3个月；10～15℃不超过20日；16～25℃不超过14日；26～30℃不超过7日。
2.冻干疫苗的有效保存期：-15℃最长不超过2年；0～4℃最长不超过8个月；10～15℃最长不超过3个月；25～30℃最长不超过10日。
3.使用要点：本疫苗对初生雏鸡滴鼻时有激发支原体病的可能，有时会引起轻微的呼吸道症状，一般用于7日龄以上雏鸡较好；考虑鸡群可能潜伏支原体病，如用本疫苗进行气雾免疫，鸡龄应有一个月以上。滴鼻免疫时用生理盐水、蒸馏水或冷开水（严禁用热水、温水及加消毒剂的水如城市自来水）将疫苗稀释10倍，滴入鼻孔内2滴（约0.05毫升）；饮水免疫时用冷开水或井水（忌用含氯等消毒剂的水）稀释，不论鸡龄大小平均每只鸡饮用实含病毒量0.01毫升（克）。疫苗稀释后应放冷暗处并当天用完，免疫后7～8天产生免疫力。
四、鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗制造：
（一）毒种：由中国兽药监察所鉴定保管和供应，必须符合以下标准：对鸡胚的毒力为绒毛尿囊膜上接种最小感染量不低于10⁻⁵/0.2毫升，绒毛膜明显水肿增厚并有灰白色痘斑、胎儿无肉眼可见病变；对鸡涂抹毛囊或刺种最小发痘量不低于10⁻⁴；用刺种法对鸡的最小免疫量不低于10⁻⁴；毒种须无菌。
毒种继代：将无菌毒种（绒毛尿囊膜）用生理盐水作成10⁻²或10⁻³悬液，以0.2毫升接种于11～12日龄鸡胚绒毛尿囊膜上，35～37℃孵育，弃去死胚，将第五天活的鸡胚冷却致死，无菌采取有明显病变的绒毛尿囊膜。
毒种保存：湿毒-15℃以下不超过1年、0～4℃不超过2个月；冻干毒-15℃以下不超过6年、0～4℃不超过1年。
（二）疫苗制造：制苗鸡蛋经清除壳外污物后置38.5～39℃孵化，相对湿度60%～70%；选用11～12天胎儿发育良好的鸡胚，以10⁻²或10⁻³稀释毒种0.2毫升接种绒毛尿囊膜（或0.1毫升接种尿囊内），石蜡密封后35～37℃继续孵育。接种后每天检蛋1次，4天前死胚剔出；第4、5天死亡且培养无菌、绒毛尿囊膜病变明显者亦可用于制苗；第5天收获，活胚先冷却致死，无菌采取有水肿或痘斑胚的整个绒毛尿囊膜冻结保存，同时吸取尿囊液作无菌检验和鸡红细胞凝集试验，选无菌且无凝集现象者用于制苗。
配制疫苗：
（三）疫苗的检验：
1.无菌检验：甘油苗需无菌生长；冻干苗有菌生长时应作杂菌病原性鉴定及杂菌计数，并作鸡白痢等沙门氏菌检验应为阴性，每克组织含杂菌数不应超过1000个。
2.安全检验：①用1～2周龄未经鸡痘免疫且无鸡新城疫抗体的雏鸡5只，每只尿囊内接种10倍稀释疫苗0.2毫升，观察7～10日应健活。②用确知未经新城疫免疫鸡群所产蛋孵育的鸡胚5个，每胚尿囊内接种10倍稀释疫苗0.1～0.2毫升，观察120小时，将死胚尿囊液混合、活胚分别收取尿囊液作鸡红细胞凝集试验应为阴性；如血凝阴性且鸡胚死亡数在2/5（含）以下，判为安全。
3.效力检验：①用鸡胚作效检：疫苗按组织含量稀释成10⁻⁵，用11～12日龄鸡胚5个分别于绒毛尿囊膜接种0.2毫升，96～120小时观察，全部鸡胚绒毛尿囊膜应有水肿增厚或痘斑判为合格。②用鸡作效检：疫苗按组织含量稀释成10⁻⁴，用2～12月龄鸡3只分别于翅膀内侧无血管处刺种1针，第4～6天刺种部位发生痘肿判为合格。
（四）保存及使用：
五、氢氧化铝胶菌苗的制造：
（一）氢氧化铝胶的制备：①液为浓氨水500毫升加蒸馏水4500毫升，装入带胶管的下口瓶；②液为硫酸铝钾1000克加蒸馏水10000毫升加热到60℃放入大盒内。将①液加入到②液中，慢加快搅，当①液剩约1000毫升时停止加入并测pH（6～9左右）；静置弃上清，用蒸馏水洗3～4次（每次均静置弃上清）；测pH后分装再静置弃上清，高压备用。
（二）菌苗制造：
（三）菌苗检验：无菌检验按成品检验规定进行；安全检验用4～12月龄健康鸡2只各肌肉注射菌苗4毫升观察10天应健活；效力检验选用4～12月龄健康鸡（鸭）4只各肌注2毫升，14～21天后与对照2只各肌注致死量A型多杀性巴氏杆菌强毒菌液，观察10～14天，对照全死而免疫组保护2～4只以上判为合格。
（四）保存和使用：自加甲醛杀菌日起，2～15℃保存有效期1年，28℃以下阴暗处9个月；两个月龄以上鸡或鸭均可使用，每只肌肉注射2毫升。
六、灭活脏器组织苗的制造：
七、油乳剂灭活疫苗的制备：以矿物油（工业用10号白油，石蜡油更佳）作佐剂制成油包水型灭活苗，抗原以小溶液滴形式包裹在油滴中。优点是抗原缓慢释放、起抗原库作用，免疫效果好且保护力持续时间长；缺点是含油佐剂对机体有刺激，有时注射局部会发生严重炎症反应，且吸收慢可能影响临近屠宰期动物的胴体品质。
八、猪瘟兔化弱毒苗的制备：用疫苗种毒接种健康家兔后，取有典型体温反应的接种家兔的血、脾、淋巴结（在发热期采取；如是全血要加抗凝剂且不用稀释可直接用），研磨后作1:100稀释，无菌过滤，每头猪不论大小均皮下或肌肉注射1毫升，免疫期1年。
本苗现用现制，若低温（-20℃）可保存2～3年，但不能反复冻融。每只成年兔的组织制成苗后大约可供200～300头猪免疫用。
第四部分 抗体制备技术。
一、抗法氏囊病高免卵黄抗体的制备：
二、抗新城疫高免血清的制备：
三、猪瘟高免血清的制备：
四、抗体提纯技术：
（一）硫酸铵盐析法：
原理：硫酸铵是一种中性盐，加入蛋白溶液后由于其脱水作用和电离后的离子中和作用，可使蛋白质脱水和表面电势下降从而凝集沉淀。离子强度不同被沉淀的蛋白质也不同，33%～50%饱和度硫酸铵可使大部分免疫球蛋白沉淀。
试剂：取硫酸铵（AR）800克加至70～80℃热蒸馏水1000毫升中搅拌使其大部分溶解，室温过夜后上清液即为饱和硫酸铵溶液，必要时用浓氨水或6 mol/L硫酸调至所需pH。
操作：自血清中提取γ球蛋白可用50%饱和度盐析一次，也可先用50%再用33%饱和度盐析。方法为将1份血清加1份生理盐水，在搅拌下滴加2份饱和硫酸铵溶液，4℃静置2小时后2000转/分离心20分钟吸弃上清；再用33%饱和度硫酸铵（饱和硫酸铵1份加蒸馏水2份）处理，加入量约为沉淀物体积的20倍，充分搅拌后4℃静置2小时同法离心，重复一次。将沉淀物溶于2倍体积生理盐水，置透析袋中对生理盐水透析至铵离子除尽（可用纳氏试剂测定），即为γ球蛋白组分。
附注：盐析时蛋白质浓度影响较大，一般需先稀释至25.0～30.0 g/L；加饱和硫酸铵应在搅拌下缓慢滴入以防局部浓度过高引起无关蛋白共沉，只有蛋白含量＜10.0 g/L时方可一次加入；加硫酸铵后应4℃静置数小时或过夜使蛋白质充分沉淀。
（二）辛酸法：
原理：辛酸是一种短链脂肪酸，在酸性条件下可使绝大部分血浆蛋白和α、β区带的球蛋白成分沉淀，而免疫球蛋白仍保留在上清液中；将上清液pH调至偏碱性后再加入硫酸铵使达45%饱和度，即可将免疫球蛋白沉淀。
试剂：①0.06 mol/L pH 4.0醋酸盐缓冲液（0.06 mol/L醋酸钠180毫升与0.06 mol/L醋酸820毫升混合）；②1.0 mol/L与0.1 mol/L NaOH；③10倍浓缩磷酸盐缓冲液（10×PBS）：NaCl 80.0克、KCl 20.0克、Na₂HPO₄ 11.5克、KH₂PO₄ 2.0克、0.1 mol/L EDTA 20毫升，蒸馏水溶解后补足至1000毫升，pH 7.4；④辛酸。
操作：
附注：加辛酸前样品应适当稀释（1份样品加4份醋酸缓冲液为好），否则白蛋白与α、β球蛋白不能完全沉淀；pH影响很大——pH 4.2和4.5时杂蛋白可完全沉淀，pH 4.8时某些α、β蛋白不被沉淀，pH 5.1时白蛋白也不能完全沉淀，pH过低免疫球蛋白得率显著下降；辛酸浓度＜20 μL/mL或＞30 μL/mL均会引起杂蛋白沉淀不完全，推荐25 μL/mL，若稀释后总量＜5毫升则以30 μL/mL为好。
（三）DEAE-纤维素批量法：
原理：DEAE-纤维素是一种阴离子交换剂。当蛋白质溶液pH高于蛋白质等电点时蛋白质带负电荷，分子中的羧基阴离子与DEAE-纤维素的Cl⁻交换而被吸附到交换剂上。不同蛋白质的分子大小和荷电状态不同，与交换剂结合的紧密程度也不同，改变缓冲液的离子强度或pH可使结合状态改变（解吸附），从而达到分离纯化目的，用此法可自血清中提取较纯的IgG。
试剂：①0.5 mol/L NaOH（NaOH 20.0克溶于蒸馏水补足至1000毫升）；②0.5 mol/L HCl（浓HCl 42毫升加蒸馏水至1000毫升）；③0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液（PB）：Na₂HPO₄·12H₂O 14.51克、NaH₂PO₄·2H₂O 1.48克溶于蒸馏水补足至5000毫升；④DEAE-纤维素（以DE-32为例）。
DE-32处理：用0.5 mol/L NaOH反复浸泡至上清液不再呈黄色，换蒸馏水浸泡至近中性；再用0.5 mol/L HCl浸洗2次，倾去后用蒸馏水浸洗至上清液pH与水同；再用0.5 mol/L NaOH浸洗一次，蒸馏水洗至近中性；用0.01 mol/L pH 7.4 PB反复浸泡平衡后尽可能滤除水分（可在铺有滤纸的布氏漏斗内减压抽滤）。
操作：血清1份加蒸馏水2份混匀；按每毫升原血清用8～10克湿重的DE-32，将稀释血清加至处理好并滤干的DE-32中充分混匀，4℃放置1小时（其间搅匀2～3次）后倾至布氏漏斗滤纸上减压抽滤，滤液即为IgG；再用少量PB洗滤一次，两次滤液合并后加入适量80.0 g/L NaCl使成等渗。
附注：DEAE-纤维素的处理应严格，特别是最后用0.01 mol/L pH 7.4 PB浸泡平衡这一步；DEAE-纤维素与血清的比例对IgG纯度影响甚大，量不足则杂蛋白显著增多；用于提取IgG的血清必须预先稀释，否则也会使提取物不纯。
下载地址：{{downurl}}
{{{a}}}
{{#b}}{{{b}}}
{{/b}} {{/title}} {{#nolog}}登陆注册
{{/nolog}} {{#djsx}}点我刷新
{{/djsx}} {{#gocz}} {{/gocz}} {{#ffqr}} {{/ffqr}}