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本课件为基础化学「吸光光度法」章节，依次讲解第一节吸光光度法的基本原理、第二节光吸收的基本定律、第三节吸光光度法分析条件的选择等内容，配合典型例题与计算示例，帮助掌握本章的基本概念、原理与计算方法。
吸光光度法：本章目录如下。
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、可见吸光光度法、紫外吸光光度法和红外光谱法等。吸光光度法属于仪器分析方法，它所测定的是物质对光的吸收程度。吸光光度法主要具有以下特点：（1）测定的灵敏度高。常用于测量质量分数为10-3 ％~ 1％的微量组分，甚至可测定质量分数低至10-5 ％~ 10-4 ％的痕量组分。（2）测定的准确度较高。一般吸光光度法测定的相对误差为2％~ 5％，若使用精密仪器，相对误差可降至1％~ 2％，完全可以满足微量组分测定的要求。
（3）仪器设备简单，操作简便、快速，选择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发现，提高了选择性，一般不需分离干扰物质就能进行测定。（4）应用广泛。几乎所有的无机离子和具有共轭双键的有机化合物都可以直接或间接地用吸光光度法进行测定。
第一节吸光光度法的基本原理一、光的基本性质二、物质对光的选择性吸收三、吸收曲线
一、光的基本性质光是一种电磁波，如果按波长或频率排列，有如下所示的电磁波谱。波谱名称波长范围分析方法γ射线0.005 ~ 0.17nm中子活化分析，穆斯堡尔谱法X射线0.1 ~ 10nmX射线光谱法远紫外10 ~ 200nm真空紫外光谱法近紫外200 ~ 400nm紫外光谱法可见光400 ~ 760nm比色法，可见吸光光度法
近红外0.76 ~2.5红外光谱法中红外2.5 ~ 50红外光谱法远红外50 ~ 1000红外光谱法微波1 ~ 1000 mm 微波光谱法射频1 ~ 1000 m 核磁共振光谱法光具有波粒二相性。光的波长λ、频率、速率c、能量E 之间的关系为：不同波长的光具有不同的能量，光的波长越短，光的能量就越大；光的波长越长，光的能量就越小。
二、溶液对光的选择性吸收人的眼睛能感觉到的光称为可见光，其波长大约在400 ~ 760 nm范围内。通常将具有同一波长的光称为单色光，由不同波长的单色光组合得到的光称为复合光。溶液之所以呈现不同的颜色，是由于溶液对不同波长的单色光选择吸收而产生的。当一束白光通过一有色溶液时，某种波长的单色光被溶液吸收，而其他波长的单色光透过溶液。因此，溶液呈现的颜色取决于透过光的颜色。
物质的颜色吸收光物质的颜色吸收光颜色λ/nm颜色λ/nm黄绿紫400 ~ 450紫黄绿560 ~ 580黄蓝450 ~ 480蓝黄580 ~ 600橙绿蓝480 ~ 490绿蓝橙600 ~ 650红蓝绿490 ~ 500蓝绿红650 ~ 760紫红绿500 ~ 560如果将两种单色光按适当的比例混合后得到白光，则这种单色光称为互补色光。显然，透过光和吸收光是互补色光。物质的颜色与吸收光颜色的关系
三、吸收曲线如果将不同波长的光通过一定浓度的某一溶液，分别测定溶液对各种波长的光的吸光度。以入射光的波长λ 为横坐标，相应的吸光度A 为纵坐标作图，可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称为吸收曲线或吸收光谱。
KMnO4 的吸收曲线
第二节光吸收的基本定律一、Lambert-Beer 定律二、偏离Lambert-Beer 定律的原因
一、Lambert-Beer 定律吸光度和透光率的定义分别为：吸光度与透光率的关系为：A =－lgT
1760 年，Lambert 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。A = k1· d1982年，Beer 指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。A = k2 · cB将Lambert 定律和Beer 定律合并起来，就得到Lambert-Beer 定律。例题
例13-1 用邻菲罗啉法测定铁，已知Fe2+ 的质量浓度为1.010-3 g·L-1。用2cm吸收池，在波长508nm 处测得吸光度A 为0.38，计算铁邻菲罗啉配离子的摩尔吸收系数。解：Fe3+浓度为：1mol Fe2+能生成1mol Fe 邻菲罗啉配离子，因此配离子浓度也为。
若溶液的组成用质量浓度表示。Lambert-Beer 定律可表示为：κ 与a 的关系为：溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之间没有相互作用，则溶液吸光度等于各吸光物质的吸光度之和。
二、偏离Lambert-Beer 定律的原因根据Lambert-Beer 定律，以A 为纵坐标，以cB或ρB 为横坐标作图，应得到一条通过原点的直线。但在实际测定中，常会出现标准曲线偏离直线的现象，曲线向上或向下发生弯曲，这种现象称为偏离Lambert-Beer 定律。
标准曲线的偏离
1.非单色光引起的偏离假设入射光仅由
对波长为的单色光：对波长为的单色光：
实际测定时，只能测得它们的总吸光度A总。由于总入射光强度为I01＋I02，总透射光强度为I1＋I2 ，故：若κ1＝κ2＝κ，则有：
即总吸光度A总与浓度cB仍服从Lambert-Beer 定律。此结论可能对应以下两种不同的情况：（1）很小，可近似认为，入射光近似为单色光，故A 与cB仍成正比。（2）尽管较大，但在所选择的入射光波长范围附近吸收曲线较平坦，因此κ变化较小，故A 与cB仍保持较好的线性关系。若较大时，不等于，则A 与cB 不成正比而偏离Lambert-Beer 定律，与相差越大，偏离就越显著。
2.非平行入射光引起的偏离若入射光束为非平行光，就不能保证光束全部垂直通过吸收池，可能导致光束通过吸收池的实际平均光程大于吸收池的厚度，使实际测得的吸光度大于理论值，从而导致与Beer定律产生正偏离。
3. 介质不均匀引起的偏离若溶液中生成溶胶或发生浑浊，当入射光通过该溶液时，除一部分被吸光物质吸收外，还有一部分被溶胶粒子和粗分散粒子散射而损失，使透光率减小，实测的吸光度偏高，从而对Lambert-Beer 定律产生正偏离。
1.溶液浓度过高引起的偏离若吸光物质
被测吸光物质在溶液中常发生缔合、解离、互变异构、逐级配位等反应，形成新的化合物而改变了其平衡浓度与分析浓度之间的正比关系，从而导致偏离Lambert-Beer 定律。
第三节吸光光度法分析条件的选择一、显色反应及其条件二、测定波长的选择三、吸光度范围的选择四、参比溶液的选择
一、显色反应及其条件可见光区的吸光光度法只能用于测定有色溶液。对无色溶液和颜色较浅的溶液进行测定时，必须加入一种能与被测组分反应生成颜色较深的有色化合物的试剂，然后再进行测定。将被测组分转变成有色化合物的化学反应称为显色反应，能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂称为显色剂。
显色剂必须满足下述条件：（1）灵敏度要高：可见吸光光度法一般用于微量组分的测定，因此要求选择的显色剂能与待测组分生成摩尔吸收系数较大的有色化合物。生成的有色化合物的摩尔吸收系数越大，对入射光的吸收程度越大，测定的灵敏度就越高。（2）选择性要好：选用的显色剂最好只与待测组分发生显色反应，而与溶液中共存的其他干扰离子不显色，或者显色剂与被测组分所生成的有色化合物的颜色和显色剂与干扰离子所生成有色化合物的颜色有明显的不同。
（3）显色剂与被测组分生成的有色化合物要有足够的稳定性，不易受外界条件的影响而发生变化。（4）显色剂与被测组分生成的有色化合物的组成要恒定，符合一定的化学式，否则测定的再现性就较差。（5）有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要足够大，一般要求相差60 nm 以上。
（二）显色条件的选择1.显色剂的
吸光度与显色剂用量的关系
2. 溶液的酸度溶液的酸度对显色反应的影响主要表现在以下三个方面：（1）溶液的酸度对被测组分存在状态的影响：大多数被测金属离子易水解，当溶液pH 增大时，可能生成各种类型的氢氧基配合物，甚至生成氢氧化物沉淀，使显色反应不能进行完全。
（2）溶液的酸度对显色剂的平衡浓度和颜色的影响：大多数显色剂是有机弱酸或有机弱碱，当溶液的pH变化时，将影响显色剂的平衡浓度，并影响显色反应的完全程度。另外，有一些显色剂本身就是酸碱指示剂，它们在不同pH的溶液中具有不同的结构，而产生不同的颜色，所以对显色反应也有影响。
（3）溶液酸度对有色化合物组成的影响：在不同pH 的溶液中，显色剂与待测离子形成的有色化合物的组成往往不同，其颜色也不同。必须控制合适的pH，才能获得好的分析结果。不同的显色反应的适宜pH 是通过实验确定的。具体方法是: 固定溶液中被测组分和显色剂的浓度，改变浓度的pH ，测定此pH 下溶液的吸光度，以pH 为横坐标，以吸光度为纵坐标，作出pH 与吸光度的关系曲线，从中可找出适宜的pH 范围。
pH 与吸光度的关系曲线
3. 显色温度显色反应一般在室温下进行，但有些显色反应需要加热到一定温度时才能完成，而有些化合物当温度较高时又容易发生分解。对不同的显色反应，应通过实验找出各自的最佳温度范围。4 . 显色时间通过实验来确定合适的测定时间。实验的方法是配制一份待测溶液，从加入显色剂起计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t 关系曲线，根据曲线选择合适的测定时间。
二、测定波长的选择选择溶液具有最大吸收的波长λmax 作为入射波长。在λmax处最大，使测定具有较高的灵敏度；同时，在λmax处的一个较小范围内，吸光度变化较小，不会偏离Lambert-Beer定律，也使测定具有较高的准确度。如果干扰物质在λmax处也有强烈吸收时，可选用非最大吸收处的波长，但应尽可能选择随波长改变而变化不大的区域内的波长。
三、吸光度范围的选择在吸光光度分析中，分光光度计的读数误差也是测定误差的主要来源之一。对于同一台仪器，透光率读数的绝对误差基本上为一定值。由于透光率T 与试样溶液浓度cB 之间为对数关系，因而在不同的透光率读数范围内，这一恒定误差所引起的浓度cB 的测定的相对误差是不同的。
以上两式相除：上式也可改写成：根据Lambert-Beer 定律：当液层厚度d 为定值时，将上式微分：
不同透光率时测定浓度的相对误差ΔcB/cB(ΔT=0.01)T/% 95 90 80 70 60 50 36.83020 10 5 2 20.6 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 13.0 测定相对误差与透光率的关系
在T = 36.8%（A=0.434）时，浓度测定的相对误差最小。在实际测定时，常将吸光度控制在0.2 ~ 0.7（T=20% ~65%）之间，以减小浓度测定的相对误差。
四、参比溶液的选择选择参比溶液的原则如下：（1）如果仅待测组分与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液。（2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，可用不含待测组分的试剂溶液作参比溶液。（3）如果试样中的其他组分也有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液；当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂，将待测组分掩蔽后，再加入显色剂，以此溶液作参比溶液。
第四节分光光度计一、基本部件及性能二、几种常用的分光光度计
一、基本部件及性能分光光度计的基
单色器是将光源发出的连续光谱分解
（三）吸收池吸收池也称比色皿
（1）光电池：常用的光电池是硒光电池，当光照射在光电池上时，半导体硒表面就有电子逸出，被收集于金属薄膜上，因此带负电，成为光电池的负极。由于硒的半导体性质，电子只能单向移动，使铁片成为正极。通过与电阻很小的外电路连接，能产生10~100 的光电流，可直接用检流计测定，电流大小与照射光强度成正比。
（2）光电管：光电管是由一个阳极和光敏阴极组成的真空（或充有少量惰性气体）二极管，阴极表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏材料，当它被具有足够能量的光照射时，能够发射电子。当两极间有电位差时，发射出的电子就流向阳极而产生电流，电流的大小取决于入射光的强度。
（3）光电倍增管：光电倍增管中有一个光敏阴极和若干个倍增光敏阴极，当光照射光敏阴极时发射出电子，由于外电场的加速作用，这些电子高速轰击相邻的第一阴极，该阴极经电子轰击后又产生次级电子，其数目较入射的电子多，这些电子再次被加速轰击第二阴极，从而发射出更多的电子。通常使用9~12个这种阴极，可将电流放大几百万倍以上。最后倍增了电子射向阳极形成电流，光电流通过负载电阻可变成电压信号，经放大后将信号输入读数指示器。
（五）读数指示器读数指示器的作用是把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。检流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光率，测定时一般可直接读出吸光度。
二、几种常用的分光光度计
由光源1发出的光照射到聚光透镜2上，会聚后经反射镜7转角后，反射至入射狭缝6（狭缝正好位于准光镜的焦面上），再经狭缝射至准光镜4，被4反射以一束平行光射向色散棱镜3，光线进入3被色散后依原路稍偏转一个角度反射回来，这样从色散棱镜3色散后出来的光线再经过准光镜4反射后，就会聚在出射狭缝6上（出射狭缝和入射狭缝是一体的），经聚光透镜9后，照射在吸收池10上，未被吸收的光通过光门11照射在光电管13上。
（二）751 型分光光度计
光源有钨灯1和氢灯2各一只，可按需要转换，钨灯适用于可见吸光光度法测定；氢灯发射150~400nm波长的光，适用于200~400nm波长范围内的紫外吸光光度法测定。光源2发出的光经凹面镜3反射成平行光，到达平面反光镜7转角，通过狭缝6至准直镜5，进入石英棱镜4，色散后再经准直镜5聚焦至出光狭缝6，经透镜9后通过吸收池8，透射光进入光电管10或11。光电管有红敏（625~1000nm）和蓝敏（200~625nm）两只，可通过手柄转换。光电流经放大后推动指零电表，电表指针偏离零位时，转动读数指示器（标有A和T刻度）使其回复到零。指示器所指数值即为被测溶液的吸光度和透光率。
第五节可见吸光光度法的应用一、单组分的测定二、多组分的测定
一、单组分的测定试样中某种微量组分的测定，通常采用标准曲线法。先配制一系列不同浓度的被测组分的标准溶液，在选定的波长和最佳操作条件下，分别测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标作图，得到标准曲线。再在相同的操作条件下，测定试样溶液的吸光度，然后从标准曲线上查得试样溶液的浓度。
二、多组分的测定对于含有多种被测组分的试液，如果吸光物质之间没有相互作用，且服从Lambert-Beer定律，此时系统的吸光度等于各组分的吸光度之和。吸收光谱通常有以下两种情况。（1）吸收光谱互不重叠：在某一波长λ1处，X有吸收，而Y 不吸收；在另一波长λ2处，Y 有吸收，而X 不吸收。可以分别在波长λ1 和λ2 处，测定组分X 和Y 的吸光度，而互相不发生干扰。
吸收光谱不重叠吸收光谱重叠
（2）吸收光谱重叠：在吸收光谱中找出两个波长λ1和λ2下，X和Y的吸光度相差较大。可分别在波长λ1 和λ2 处测定试液的吸光度和，由吸光度的加和性得联立方程：解此联立方程，可求得cx 和cY。
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